Лабораторные работы по физиологии растений

На поверхности раздела растворов двух веществ образуется

мономолекулярная полупроницаемая "осадочная" пленка из

железистосинеродистой меди по реакции:

К4Fe(CN)6 + CuSO4 Cu2Fe(CN)6 + К2SO4

Работа 2. Определение осмотического давления клеточного сока методом плазмолиза.

Задание. Рассчитать величину осмотического давления клеточного сока растительной клетки. Зарисовать клетки с различной степенью плазмолиза и в тургорном состоянии.

Материалы и оборудование. Лук, микроскоп, ланцет, предметное стекло,

семь бюксов, градуированная пипетка на 10 мл, часы, фильтровальная бумага,

1M NaCl.

Ход работы. 18-20 микроскопических с срезов морфологически нижней стороны эпидермиса лука окрашиваются в течение 5 мин краской нейтральрот.

Срезы промывают и помещают в дистиллированную воду. Одновременно готовят растворы NaCl различной концентрации (табл. 1) путем смешивание 1М

раствора соли с водой.

Растворы готовят в бюксах с этикеткой, соответствующей заданной концентрации. В каждый раствор, начиная с самой высокой концентрации и заканчивая водой, через каждые 5 минут погружают по 3 препарата,

предварительно поверхностно просушенные фильтровальной бумагой от капель воды.

После 30-минутной экспозиции срезы с каплей раствора переносят на предметное стекло и просматривают под микроскопом. Путем микроскопирования устанавливают состояние протопласта в каждом конкретном растворе и результаты записывают в таблицу.

11

Таблица 1

Влияние концентрации внешнего раствора на степень плазмолиза протопласта

По данным таблицы 1 определяют концентрацию NaCl, равную

/изотоническую/ концентрации клеточного сока. Изотоническая конценетрация

NaCl находится в пределах, между концентрацией, вызывающей начальную степень плазмолиза /отставание протопласта от клеточной оболочки по уголкам клетки/, и концентрацией, при которой отсутствует плазмолиз.

Величина изотонической концентрации NaCl подставляется в формулу, по которой рассчитывается осмотическое давление клеточного сока:

P = C * T * R * i

где

P искомое осмотическое давление, атм ;

R газовая постоянная /0,0821 л атм/моль/;

T абсолютная температура /273° + комнатная t C;

i изотонический коэффициент, характеризующий степень диссоциации растворенного вещества.

Таблица 2

Степень диссоциации раствора NaCl

12

Лабораторное занятие 2.

Определение изоэлектрической точки растительных тканей

Изоэлектрическая точка определяется как значение pH, при котором в электрическом поле не происходит суммарной миграции, в то время как изоионная точка определяется как значение pH, при котором на молекуле нет суммарного заряда. В деионизированном растворе изоэлектрическая и изоионная точки для большинства целей идентичны.

Аминокислоты и белки цитоплазмы являются амфотерными веществами.

Они содержат и основную аминную, и кислую карбоксильную группы.

Количество положительных и отрицательных зарядов уравновешивается.

Значение pH среды, при котором в молекуле белка наблюдается равенство положительных и отрицательных зарядов, т. е. она становится электронейтральной, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). Каждый амфолит имеет свою величину ИЭТ. У белков и аминокислот она зависит от количества свободных кислот (карбоксильных) и основных (аминных) групп.

Когда амфолит диссоциирует как основание (в средах с рН ниже ИЭТ),

своим положительным зарядом он будет связывать анионы. Если амфолит диссоциирует как кислота (в средах выше ИЭТ), его отрицательный заряд связывает катионы. При окрашивании белков тканей этими красками и погружении их среды, pH которых ниже ИЭТ, белки, связывая преимущественно анионы эозина, будут иметь розовую окраску.

В цитоплазме клеток разных тканей находится смесь белков, поэтому переходная зона будет соответствовать более или менее широкому интервалу рН.

Задание. Определить ИЭТ для клеток различных тканей первичного корешка подсолнечника или гороха. Результаты наблюдений зарисовать.

Материалы и оборудование. Проросшие семена подсолнечника или гороха, лезвие безопасной бритвы, восемь пробирок, четыре часовых стекла,

кисточка, препаровальная игла, микроскоп, предметные стекла, 0,1M лимонная

13

кислота, 0,2M Na2HPO4, 0,1% раствор эозина, 0,01% раствор метиленовой синей,

две пипетки на 10 мл, две бюретки на 25 мл, стандартный лист миллиметровой бумаги.

Ход работы. 1. Приготовить в пробирках 8шт. буферных растворов в соответствии с табл.3.

2. Окрашивание срезов. Для этого на четыре часовых стекла наливают раздельно 5 мл 70% этилового спирта, 3 мл 0,1% раствора эозина, 3 мл 0,01%

раствора метиленовой синей, 5мл дистиллированной воды.

По мере приготовления тонкие поперечные срезы в количестве 24 шт.

вначале помещают для фиксации в спирт на 5 мин. Из спирта с помощью кисточки срезы переносят в эозин, затем в метиленовую синюю. В каждом из красителей препарат выдерживают по 10 мин. После окрашивания срезы промывают 2-3 мин в дистиллированной воде. Отмытые препараты помещают по 3 шт. в каждую из пробирок с буферным раствором на 1,5-2 ч.

3. Определение ИЭТ растительной тканей. После экспозиции в буферных растворах срезы переносят на предметное стекло и размещают в три ряда последовательно в соответствии с увеличением рН. При микроскопировании

14

выбирается один из трех препаратов для каждого значения рН с наиболее заметной окраской.

В растворах со значением рН ниже ИЭТ белков исследуемой ткани метиленовая синяя десорбируется в раствор, а ткань, удерживающая розовый краситель-эозин, будет окрашена в розовый цвет. Наоборот, в буферных растворах с pH выше ИЭТ ткани, белками будет удерживаться метиленовая синяя, и ткань окрасится в синий цвет.

При величине рН буферного раствора, равной ИЭТ, кислый и основной красители адсорбируются в равных количествах и ткань приобретает сиреневую или фиолетовую окраску.

Примечание. Если в опыте не удается обнаружить буферного раствора по промежуточной окраске, то ИЭТ можно вычислить как среднюю величину,

лежащую между резким переходом между цветами - розовым и синим.

15

Лабораторное занятие 3.

Общие свойства ферментов на примере амилазы

Ферменты - это белки, которые помогают ускорить химические реакции в нашем организме. Ферменты необходимы для пищеварения, функции печени и многого другого. Слишком много или слишком мало определенного фермента может вызвать проблемы со здоровьем. Ферменты в нашей крови также могут помочь медицинским работникам проверить наличие травм и заболеваний. Что такое ферменты?

Ферменты - это белки, которые помогают ускорить обмен веществ или химические реакции в нашем организме. Они создают одни вещества и расщепляют другие. У всех живых существ есть ферменты.

Наши тела естественным образом вырабатывают ферменты. Но ферменты также содержатся в промышленных продуктах и продуктах питания. Каковы различные типы ферментов?

В организме существуют тысячи отдельных ферментов. Каждый тип фермента выполняет только одну функцию. Например, фермент сахараза расщепляет сахар, называемый сахарозой. Лактаза расщепляет лактозу,

разновидность сахара, содержащегося в молочных продуктах.

Вот некоторые из наиболее распространенных пищеварительных ферментов:

Карбогидраза расщепляет углеводы на сахара.

Липаза расщепляет жиры на жирные кислоты.

Протеаза расщепляет белок на аминокислоты.

Каждый фермент имеет “активный центр”. Эта область имеет уникальную форму. Вещество, с которым работает фермент, является субстратом. Субстрат также имеет уникальную форму. Фермент и субстрат должны подходить друг другу, чтобы работать.

16

Как температура и рН влияют на ферменты?

Ферментам нужны правильные условия для работы. При неправильных условиях ферменты могут менять форму. Затем они больше не подходят к подложкам, поэтому работают неправильно.

Каждый фермент имеет идеальную температуру и рН:

pH: Ферменты чувствительны к кислотности и щелочности. Они не

работают должным образом, если среда слишком кислая или

щелочная. Например, фермент в желудке, называемый пепсином, расщепляет белки. Если в вашем желудке недостаточно кислоты, пепсин не может

функционировать оптимально.

Температура: Ферменты работают лучше всего, когда температура

вашего тела нормальная, около 98,6 ° F (37 ° C). С повышением температуры усиливаются ферментативные реакции. Но если температура становится

названию субстрата, который они модифицируют (т.Е. уреазы и тирозиназы),

или типу реакции, которую они катализируют (дегидрогеназа,

декарбоксилаза). Некоторые из них имеют произвольные названия (пепсин и трипсин). Международный союз биохимии и молекулярной биологии присваивает каждому ферменту имя и номер для их идентификации.

Ферменты подразделяются на шесть категорий в зависимости от типа катализируемой реакции:

Оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, лигазы и изоме

разы.

Удельная активность - это количество фермента на миллиграмм белка,

присутствующего в образце. Молярная активность или число оборотов - это количество молекул субстрата, превращенных в продукт в единицу времени на молекулу фермента в условиях насыщения субстратом.

17

Скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству ферментов, присутствующих в образце.

Работа 1. Получение вытяжки фермента (амилазы).

Задание. Получить вытяжку (фильтрат) амилазы.

Материалы и оборудование. Ячменный солод, ступка, водный раствор глицерина, мерный цилиндр, пробирка, воронка, фильтраты, капельница.

Ход работы. 3 г ячменного солода тщательно растереть в ступке. Муку залить 20 мл водного раствора 50% глицерина, перемешать, настоять 10 мин и затем профильтровать.

Фильтрат слить в капельницу. Полученная вытяжка содержит смесь амилаз, поэтому дальнейшем условно именуется амилазой.

Работа 2. Влияние температуры на действие ферментов (амилазы).

Задание. Установить влияние температуры на действие ферментов. Опыт зарисовать.

Начертить график зависимости каталитических свойств фермента от температуры. Сделать выводы.

Материалы и оборудование. Вытяжка фермента (амилазы) в капельнице, 0,5% раствор крахмала, раствор иода (I2+KI), дистиллированная вода, пробирки,

спиртовка, три термостата с температурой 30, 45,60 С.

Ход работы. В пять пробирок налить по 10 мл 0,5% раствора крахмала,

температуру которого довести соответственно до 20 (комнатная); 30, 45, 60 и 100

С (до закипания на спиртовке). Затем в каждую из пробирок ввести по 10 капель амилазы и растворы вернуть в исходные температурные условия на 8-10 мин.

После экспозиции из каждого раствора взять пробу в 1,0 мл и перенести в пробирки с индикаторами (9 мл Н2О + 5 капель I2). В результате взаимодействия йода с продуктами гидролиза в каждой из пробирок произойдет цветная реакция.

Примечание. Для сравнительной оценки глубины гидролиза необходимо приготовить эталон, характеризующий окрашивание крахмала йодом по рецепту: 1,0 мл 0,5% раствора крахмала + 9 мл Н2О + 5 капель I2.

18

Работа 3. Влияние концентрации фермента на его каталитические свойства

(гидролиз).

Задание. Установить влияние концентрации фермента на скорость реакций. Опыт зарисовать. Вычертить график влияния зависимости концентраций фермента на скорость реакции. Сделать выводы.

Материалы и оборудование. Вытяжка амилазы в капельнице, 0,5%

раствора крахмала, раствор йода (КI + I2), дистиллированная вода, пробирки,

штатив, термостат на 60°C.

Ход работы. В четыре пробирки налить по 10 мл 0,5% раствора крахмала.

Температуру растворов в пробирках довести до 60°C. Затем в каждую пробирку ввести соответственно по 4, 8, 16 и 32 капли амилазы. Пробирки встряхнуть и вновь поставить в термостат. Через 5-10 мин экспозиции из каждого раствора взять пробу в 1 мл и перенести в пробирку с водным раствором иода (9 мл Н2О

+ 5 капель I2). По полученной цветной шкале можно судить о результатах опыта.

19

Лабораторное занятие 4.

Ферменты класса оксидоредуктаз

Оксидоредуктазы – это класс ферментов, состоящий из глюкозооксидазы,

которая катализирует окисление глюкозы, превращая ее в D-глюконо-δ-лактон

(Muthusamy, 2015). Глюкозооксидаза является важным коммерческим ферментом, используемым в качестве поглотителя кислорода в молочных продуктах, таких как сухое молоко, смеси сухого мороженого и т.д. Он удаляет вредный кислород, необходимый при хранении, чтобы избежать токсичности,

гибели организма в пробиотических продуктах и, следовательно, потери функциональности продукта (Ory and Angelo, 1977; Ray and Rosell, 2017). Этот фермент также генерирует кислоты и перекись водорода. Образующаяся при этом перекись водорода дополнительно используется ферментом каталазой для консервирования молочных продуктов. Глюкозооксидаза является одним из самых быстрорастущих коммерческих ферментов на рынке. Коммерчески этот ферментный препарат состоит из каталазы и обычно используется вместе.

Лактопероксидаза также является типом фермента оксидоредуктазы,

который используется в коровьем молоке и молочных продуктах. Он использовался в качестве бактерицидной системы при консервировании сырого молока. Это уменьшает количество жизнеспособных микробов в молочных продуктах. Этот фермент работает путем превращения тиоцианата в гипотиоцианит под воздействием перекиси водорода, и полученное соединение обладает бактерицидными свойствами. Этот фермент активируется в присутствии перекиси водорода в системе; таким образом, коммерческие компании используют способы введения перекиси водорода в сырое молоко,

чтобы использовать этот фермент для холодной стерилизации молока. Этот метод полезен для тех стран, где нет достаточного количества энергии для использования термической обработки. Творог, приготовленный с использованием Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fragi, Salmonella typhimurium и E. coli были защищены от микробной порчи лактопероксидазной

20