Влияние распашки на биохимические свойства черноземов Юга России. Монография

4.Ферменты, выделяемые живыми клетками в течение нормального роста и деления, которые оказываются в жидкой фазе почвы. Они действительно внеклеточные ферменты, главным образом имеющие низкий молекулярный вес (20 000-40 000) и продуцируемые обильно грамположительными бактериями, грибами и корнями растений. Их внеклеточная секреция связана с выполнением определённых функций: гидролиз высокомолекулярных или нерастворимых соединений; разрушение потенциально экзогенных токсинов; растворение ткани хозяина перед инвазией патогена; растворение питательных соединений; стимулирование взаимоблагоприятных реакций с другими видами организмов. Часть этих ферментов может иммобилизоваться в почве.

5.Ферменты внутри неделящихся клеток. Это - споры грибов, цисты протозоа, семена растений, эндоспоры бактерий.

6.Ферменты, связанные (а) внутри мертвых клеток и (б) с клеточными осколками. Постоянное поступление их в почву обеспечивает определённый уровень ферментативной активности, связанный с этими компонентами.

7.Ферменты, выделяющиеся из функционирующих клеток или из лизирующихся клеток. Первоначально эти ферменты локализованы и функционируют на поверхности или внутри клеток. В почвенном растворе могут сохраняться в течение короткого периода. Многие гидролазы относятся

кэтой категории.

8.Ферменты, связанные временно в растворимые или нерастворимые фермент-субстратные комплексы.

9.Ферменты, которые адсорбированы на глинистых минералах на их внешней поверхности или внутри решётчатых структур силикатов. Ферменты, адсорбированные глинами, могут сохранить, или не сохранить каталитическую способность.

10.Ферменты, которые связаны с гумусовыми коллоидами благодаря адсорбции, сополимеризации при образовании гумусовых веществ. Ферменты, иммобилизованные на почвенных коллоидах, имеют более длинный период полураспада, чем ферменты, находящиеся в одной фазе почвы. Внеклеточные ферменты в категории 10 и в меньшей степени категории 9 могут сохраняться в течение длительного периода в почве, отложениях и на

11

суспендированных частицах в морской и пресноводной средах (Burns, 1982).

При интерпретации показателей ферментативной активности почв, определяемых экспериментально, проблемой является установить, к какой категории из указанных составляющих общего ферментного пула почвы относится эта активность. Это принципиально важная задача для фундаментального изучения почвенного метаболизма с участием ферментов. Дело в том, что распределение ферментов между различными категориями локализации не постоянное, изменяется во времени и неодинаково для различных ферментов. Многие из этих категорий представляют различные стадии "жизни" (функционирования) фермента в почве (Burns, 1982). Так, внутриклеточные ферменты живых организмов после их смерти и лизиса клеток и связанные с клеточными осколками оказываются в водной фазе почвы и в дальнейшем адсорбируются глинистыми поверхностями. Таким образом, например, ферменты в категории 7, бывшие прежде в категориях 1, 2 или 3, впоследствии могут переходить в категории 9 и 10, т.е. в иммобилизованные в почвенных компонентах состояния (Burns, 1982; Хазиев, 2005).

Для объединения различных категорий ферментов в группы по их состоянию в почве предложены следующие интегральные термины: для ферментов в категориях 5-10 - "накопленные ферменты", в категориях 4-10 - "абиотические" (Skujins, 1978) (не имеющие в данное время связи с живыми клетками организмов) и для относящихся к категориям 9 и 10 - "связанные в почве" (soil-bound) или "иммобилизованные" ферменты. Эти три группы ферментов составляют потенциально активный и динамичный ферментный фонд почвы и с некоторой условностью их можно назвать почвенными ферментами, определяющими ферментативную активность почвы (Burns, 1982; Хазиев, 2005).

В таблице 1 приведены основные группы наиболее часто используемых ферментов и их экологические функции (Dick, 1997).

Многие авторы рекомендуют биохимические свойства почв в качестве диагностических показателей из-за их способности незамедлительно реагировать на экологический стресс (Dalal, 1998). Например, активность почвенных ферментов очень чувствительна к стрессу в экосистемах и мо-

12

гут служить в качестве индикатора здоровья и устойчивости экосистем, находящихся под антропогенным прессом (Bergstrom et al., 1998; Dick, 1994; Dick and Tabatabai, 1992).

Активность ферментов является более устойчивым и чувствительным показателем биогенности почв, чем интенсивность микробиологических процессов и продуцирование почвой углекислого газа (дыхание), численность и состав микрофлоры и фауны (Галстян, 1982).

Наибольшую эффективность методы ферментативной активности почв имеют при диагностике сельскохозяйственного использования, загрязнения тяжелыми металлами, нефтью и нефтепродуктами, гидроморфизма и ионизирующих излучений (Даденко, 2013).

Важнейшую роль в почвенной биодинамике играют два класса ферментов: оксидоредуктазы и гидролазы. Это наиболее изученные классы почвенных ферментов.

В обмене веществ и энергии в почве важное место принадлежит окис- лительно-восстановительным ферментам. В основе синтеза гумусовых компонентов почвы лежат восстановительные процессы, в которых участвуют соответствующие ферменты. Различные фенольные соединения растительных остатков после их окисления при участии оксидаз переходят в биохимически активную хиноидную форму и впоследствии в результате реакций конденсации, полимеризации и связывания с азоторганическими соединениями образуют молекулы гуминовых кислот (Кононова, 1961; Ха-

зиев, 2005).

13

Таблица 1

Основные почвенные ферменты и их экологические функции и роль

14

Каталаза – одна из самых распространенных почвенных оксидоредуктаз. Каталаза (от греч. «katalio» – разрушаю) катализирует окислительновосстановительную реакцию, в ходе которой из двух молекул ядовитой для организма перекиси водорода образуется вода и кислород.

В некоторых работах по изучению каталазной активности почв отмечалось, что преимущественно биогенная природа разложения перекисей в почве сомнительна. Установлено, что многие почвенные горизонты обладают существенным запасом неорганических катализаторов и недоокис-

15

ленных соединений, которых начинают играть существенную роль в формировании так называемой псевдокаталазной активности (Зубкова, Карпачевский, 1979, 2001; Тульская, Звягинцев, 1981; Семиколенных, 2001).

По сути, существует две точки зрения на природу каталазной активности в почве. Первая из них гласит, что каталаза иммобилизуется различными почвенными компонентами, после чего приобретает устойчивость, не теряя полностью своей активности. Это позволяет говорить, что каталазная активность – устойчивый показатель (Алиев, 1975; Тульская, Звягинцев, 1981; Хазиев 1986; Семиколенных, 2001).

В иностранной литературе также есть подтверждение этой точки зрения. Поступая в почву, каталаза иммобилизуется на поверхности глинистых минералов или связывается с органическими коллоидами (PerezMateos et al., 1985; Serban et al., 1986.). Таким образом, способность к раз-

ложению экзогенной H2O2 в почве может также включать каталитическое действие "абиотических" внеклеточных каталаз. Активность фермента не связана с микробной активностью и, следовательно, достаточно устойчива и, возможно, не чувствительна к условиям окружающей среды (Nannipieri et al., 1996).

Другая точка зрения рассматривает каталазную активность почвы как проявление функционирование микробного комплекса, а именно, организмов, находящихся в активной форме и присутствующих в образце на момент определения показателя. В этом случае каталазная активность должна оказаться высоко динамичной характеристикой и следовать за изменениями биомассы организмов (Воробьева, 1978; Семиколенных, 2001).

Эту точку зрения также подтверждает ряд исследований иностранных авторов. Активность каталазы считается показателем аэробной микробиологической активности и связана с количеством аэробных микроорганизмов и плодородием почвы (Trasar-Cepeda, 1999). Она может быть связана с метаболической активностью аэробных организмов (Glinsky et al., 1986; Kızılkaya et al., 2004; Kızılkaya, Hep en, 2007) Ее активность коррелирует с численностью бактерий и грибов, катионообменной способностью, актив-

ностью дегидрогеназы (Rodriguez-Kabana, Truelove, 1970, 1982).

Активность каталазы демонстрирует значительную корреляцию с содержанием органического углерода, микробной биомассой, потреблением

16

кислорода, эмиссией углекислого газа и активностью дегидрогеназы

(Margesin et al., 2000).

Активность каталазы в почве в большей степени зависит от воздушного режима, гранулометрического состава почв, окислительновосстановительного потенциала (Алиев, 1975; Тульская, Звягинцев, 1981; Хазиев 1986).

Одни авторы (Liu et al., 2006) отмечают отсутствие зависимости активности каталазы от типа землепользования, другие наоборот отметили ее изменчивость на землях разного использования (Shi et al., 2008).

Активность каталазы показала очень хорошие результаты в качестве диагностического показателя состояния почв (Даденко, Денисова и др., 2013). Данный фермент чувствителен, и на воздействие большинства изучаемых факторов (загрязнение нефтью и нефтепродуктами, тяжелыми металлами, воздействие ионизирующих излучений, гидроморфизма и др.), кроме сельскохозяйственного использования и загрязнения пестицидами, он реагировал в сторону снижения активности.

Широкое использование каталазной активности при бимониторинге и биодиагностике почвенного покрова объясняется тем, что метод ее определения прост в применении, позволяет проводить большие объемы работ и отличается точностью воспроизведения. Уровень активности каталазы является эффективным эколого-биологическим диагностическим показателем при изучении различных видов антропогенного воздействия (Даденко, Денисова и др., 2013)

Дегидрогеназы катализируют реакции отщепления водорода, т.е. дегидрирования органических веществ, и играют роль промежуточных переносчиков водорода. Дегидрогеназа действует в анаэробных условиях. Так как дегидрогеназа существует только в живых клетках, ее активность зависит от биомассы и активности микроорганизмов в почве (Burns, 1982; Bandick et al., 1999; Microbiological Methods For…, 2006).

Дегидрогеназы катализируют широкий спектр окислительных реакций, ответственных за деградацию почвенного органического вещества (Margesin др., 2000). Почвенные дегидрогеназы могут отражать изменения в дыхательной активности микроорганизмов в ответ на изменения в окру-

жающей среде почвы (Schinner et al.,1996).

17

Некоторые экологические факторы, в том числе влажность почвы, наличие кислорода, окислительно-восстановительный потенциал, рН, содержание органического вещества, глубина почвенного профиля, температура, сезон года, загрязнение тяжелыми металлами и применение удобрений или пестицидов могут существенно влиять на активность дегидрогеназы в почвенной среде (Wolińska, Ste pniewska 2012).

Бремнер и Табатабай (Bremner, Tabatabai, 1973) обнаружили, что некоторые наиболее часто встречаемые анионы в почве, такие как нитрат ион, могут снижать значения активности дегидрогеназы, также выступая в качестве альтернативных акцепторов водорода. Еще одной проблемой данного является то, что медь также может в ходе аналитической процедуры занижать значения активности дегидрогеназы (Chander and Brookes, 1991).

Показатель активности дегидрогеназы очень чувствителен и на большинство антропогенных воздействий реагирует в сторону снижения его активности. Использование данного фермента приемлемо для диагностики последствий сельскохозяйственного использования, переувлажнения, загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами, тяжелыми металлами, воздействия ионизирующих излучений (Даденко и др., 2013).

Определение активности полифенолоксидазы и пероксидазы, участвующих в процессах гумусообразования, является дополнительной характеристикой процессов синтеза и распада гумусовых веществ. Полифенолоксидаза катализирует окисление полифенолов в хиноны в присутствии свободного кислорода воздуха. Пероксидаза же катализирует окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей. При этом ее роль состоит в активировании перекисей, поскольку они обладают слабым окисляющим действием на фенолы (Кононова, 1963).

Пероксидаза – фермент, осуществляющий окисление органических веществ почв за счет кислорода воздуха и перекиси водорода; его влияние направлено на окисление гумусовых веществ. Пероксидазы участвуют в деградации лигнина, удаление перекиси водорода в клетке и окислении токсичных веществ.

Полифенолоксидаза – фермент, участвующий в превращении органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса (Гулько, Ха-

18

зиев, 1992; Зенова и др., 2002; Сулейманов и др., 2012). Полифенолоксидаза играет ключевую роль в круговороте ароматических соединений.

Микроорганизмы и растения производят внеклеточные и внутриклеточные фенолоксидазы для различных целей. Растения используют фенолоксидазы для синтеза лигнина и других вторичных соединений. Многие грибы, но особенно аскомицеты и базидиомицеты используют внутриклеточные фенолоксидазы для синтеза защитных соединений, таких как меланин, часто в сочетании со спорообразованием или других морфогенетических процессов. Некоторые организмы используют внеклеточные фенолоксидазы для разрушения лигнина и перегноя, для получения углерода и других питательных веществ. Внеклеточные фенолоксидазы вводятся в действие грибами и бактериями, чтобы нейтрализовать токсичность фенольных молекул и ионов металлов, и для антибактериальной защиты. Но независимо от их происхождения и начальной функции, фенолоксидазы выпущенные в окружающую среду путем секреции или лизиса клеток являются независимыми агентами, которые катализируют неспецифические реакции, в том числе окисления Mn и Fe, которые могут полимеризовать, деполимеризовать или трансформировать широкий спектр фенольных молекул. Эти реакции, в свою очередь, влияют на активность и состав почвенного микробного сообщества, потому что фенольные молекулы по своей природе ток-

сичны (Sinsabaugh, 2010).

Активность полифенолоксидазы и пероксидазы зависит от влажности и температуры, а также от доступности питательных веществ и содержания гумуса (Sinsabaugh et al., 2008). Уровень активности фенолоксидаз и пероксидаз может изменяться в зависимости от содержания органического вещества и климата. Низкое содержание органического вещества почвы и засушливые условия могут стабилизировать активность (Stursova, Sinsabaugh, 2008), в то время как влажный климат и высокое содержание гумуса может уменьшить эффективную жизнь фермента (Sinsabaugh, 2010).

Экспрессия пероксидазы и полифенолоксидазы повышается в ответ на окислительный стресс, т.е. увеличение концентрации активных форм кислорода, который может быть создан с помощью различных комбинаций содержания кислорода и питательных веществ (Rabinovich et al., 2004).

19

Гидролазы представляют обширный класс ферментов, осуществляющих реакции гидролиза разнообразных сложных органических соединений, действуя на различные связи: сложноэфирные, глюкозидные, амидные, пептидные и др. Гидролазы широко распространены в почвах и играют важную роль в обогащении их подвижными и достаточными для растений и микроорганизмов питательными веществами, разрушая высокомолекулярные органические соединения. К этому классу относятся ферменты уреаза (амидаза), инвертаза (карбогидраза), фосфатаза (фосфогидролаза) и др., активность которых является важнейшим показателем биологической активности почв (Звягинцев, 1980).

Фосфор (Р) является основным питательным веществом для всех живых организмов, компонентом жизненно важных макромолекул, в том числе нуклеиновых кислот и фосфолипидов, необходимым условием для энергии, роста и развития (Hammond, White, 2008). Недостаток фосфора ограничивает рост растений в природных сообществах и агроценозах (Fraser et al., 2015).

Органический фосфор составляет значительную долю от общего фосфора в почве и является важным его источником для растений и микроорганизмов. Органический фосфор должен быть преобразован в неорганической, прежде чем он может быть использован. Почвенные микроорганизмы являются ключевыми факторами биохимического цикла фосфора, через экскреции внеклеточных ферментов, таких как фосфатазы. Фосфатазы - широкая группа ферментов, которые преобразуют органический Р в фосфа-

ты (Sharpley, 1985; Tarafdar, Jungk, 1987). Фосфатазы способны гидролизо-

вать сложноэфирные фосфатные связи (Nannipieri et al., 2011). Большинство из встречающихся в почве органофосфатов непосредст-

венно растениями не усваивается. Их поглощению предшествует ферментативный гидролиз, осуществляемый фосфогидролазами. Субстратами почвенных фосфатаз являются специфические гумусовые вещества, включающие фосфор гумусовых кислот, а также не специфические индивидуальные соединения, представленные нуклеиновыми кислотами, фосфолипидами и фосфопротеинами, а также метаболическими фосфатами. Первые накапливаются в почве в результате биогенеза гумусовых веществ, вторые,

20