Вияние орхидэктомии на иммунный статус мышей гибридов F1. Монография

хронической РТПХ в сторону Th2 в случае мышей lupus и в сторону Th1 в случае мышей nonlupus (Кудаева и др., 1993).

1.4.2. Характер нефрита при индукции РТПХ

Гломерулонефрит, развивающейся при индукции РТПХ в почках мышей-гибридов B6D2F1, имеет аутоиммунную природу, принципиально не отличается от гломерулонефрита, развивающегося при врожденном аутоиммунном синдроме, и проявляется высокой протеинурией, асцитом, ги-

поальбуминемией (Appleby et al., 1989).

Т-зависимая поликлональная активация В-клеток характеризуется продукцией аутоантител к ДНК, коллагену IY и II, ламинину. Три последних антигена являются компонентами базальной мембраны клубочков и ответственны за аутоиммунный гломерулонефрит. При развитии гломерулонефрита в экспериментальных моделях в начальных стадиях возникают аутоантитела к базальной мембране клубочков, что при иммунофлюоресценции выглядит в виде линейного свечения на базальной мембране. В связи с прогрессирующей поликлональной В-клеточной активацией нарастают количество и спектр аутоантител. Одновременно развивается дисфункция компонентов СМФ, в частности дефект фагоцитоза, что приводит к повышению уровня ЦИК в крови и избыточному осаждению их на почечных фильтрах. Компоненты ЦИК (комплемент, антигены) являются цитотоксичными и вызывают хемотаксис лейкоцитов с развитием впоследствии иммунного воспаления (Cronin et al., 1985). Морфологически линейные депозиты сменяются гранулярными (Bruijn et al., 1990). Кроме гломерулита, обнаруживают явления интерстициального продуктивного нефрита в виде преимущественно Т-клеточных инфильтратов в строме.

41

Через 10 недель после индукции РТПХ при гитстологических исследованиях наблюдается разрастание мезангиального матрикса и уплотнение стенок клубочковых капилляров. Межклеточные молекулы адгезии ICAM-1(CD54), которые экспрессируются на эндотелиальных клетках клубочков почек, обеспечивают связывание и миграцию лейкоцитов в места воспаления в тканях (под действием ИЛ-1, ИФ-α, ФНО-α в культуре эндотелиальных клеток увеличивается экспрессия молекул адгезии ICAM-1). Взаимодействие CD11a/CD54, возможно, затрагивает взаимодействие лимфоцитов и продукцию аутоАТ и клубочковый воспалительный процесс (Koostra et al., 1997). Показано, что блокада CD11a/CD54 костимуляторного пути в Т-В взаимодействии или презентации антигенов может являться помехой эпитопной специфической продукции аутоАТ. При хронической РТПХ и в других моделях иммунокомплексного гломерулонефрита для секреции аутоАТ В-клетки получают второй сигнал после поликлональной активации.

CD11a/CD54 взаимодействие является решающим в развитии нефрита у мышей с хронической РТПХ. На 4-й неделе после индукции хронической РТПХ наблюдается максимальное количество CD11a+ клеток в гломерулах, а мАТ подавляли вхождение в клубочки CD11+ клеток и уменьшали развитие гистологических нарушений в почках.

1.4.3. Роль интерлейкинов в развитии РТПХ

Хроническая РТПХ является классическим примером Th2-зависимой иммунопатологии. Данная реакция сопровождается изменением баланса между противовоспалительными и провоспалительными цитокинами (Rus et al., 1995). При этом на ранних сроках после индукции хроническая РТПХ сопровождается увеличением продукции Th1зависимых цитокинов. Уровень ИЛ-2 в сыворотке крови на-

42

чинает возрастать с первых суток после индукции РТПХ и достигает максимума через 24 – 48 ч, причем в его продукции участвуют Тh-клетки как трансплантата, так и хозяина. Показано, что увеличение продукции ИЛ-2 усиливает пролиферацию Т-лимфоцитов. Введение больших доз экзогенного ИЛ-2 в этот период тормозит развитие РТПХ (Bunjes et al., 1995). Спустя двое суток после индукции отмечается увеличение содержания мРНК ИЛ-4 и ИЛ-10, причем повышение уровня мРНК этих цитокинов наблюдается и через неделю после индукции хронической РТПХ, тогда как уровень мРНК ИЛ-2 опускается до уровня интактных животных (Rus et al., 1995). Также ИЛ-4 является классическим противовоспалительным цитокином, необходим для развития острой РТПХ, которая рассматривается как Th1зависимый иммунопатологический процесс, в то время как отсутствие ИФ-γ утяжеляет течение острой РТПХ (Murphy et al., 1998).

Тем не менее, считается, что противовоспалительные цитокины играют ключевую роль в развитии хронической РТПХ. Так, введение антител к ИЛ-4 тормозит все проявления хронической РТПХ (уровень IgE и IgG1, синтез аутоантител, патологические изменения тканей) (Ushiyama et al., 1995), напротив, введение ИФ-γ или антител к нему не влияет на течение хронической РТПХ (Umland et al., 1992).

Поляризация лимфоцитов трансплантата в Th2-сторону за счет инкубации клеток с соответствующим профилем цитокинов снижает частоту возникновения острой РТПХ после трансплантации костного мозга, но увеличивает частоту развития хронической РТПХ и выраженность ее клиниче-

ских проявлений (Fowler et al., 1994; Fowler, Gress, 2000).

Изменение цитокинового профиля путем введения при индукции хронической РТПХ в эксперименте провоспалительных цитокинов ИЛ-18 или ИЛ-12 приводит к снижению содержания аутоантител в крови животных, улучшению

43

клинического течения заболевания и увеличению выживаемости. При этом, если ИЛ-12 увеличивает частоту формирования острой формы РТПХ, то для ИЛ-18 данный эффект не отмечен (Via et al., 1994; Okamoto et al., 2000).

44

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Животные. Исследования проводились на базе НИИ клинической иммунологии СО РАМН и кафедре эпизоотологии и микробиологии НГАУ. Материалом для экспериментальных исследований служили самцы мыши – гибриды первого поколения (С57Вl/6хDBA/2)F1 В6D2F1 9-16-

недельного возраста. Количество животных в группах составляло от 8 до 10. Каждый опыт сопровождался контролем интактных животных. Содержали животных в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

Культуральные среды и реагенты. RPMI-1640 (НПО

«Вектор»), физиологический раствор, забуференный фос-

фатным буфером pH 7,4 (ЗФР); кumsai brillant blue (Loba Feinchemie); уксусная кислота; соляная кислота,; комплемент морской свинки (НПО «Биомед», г. Пермь); антитела кролика против цельной молекулы IgG мыши (RAM) (БИОС, Новосибирск); Tween 20 («Sigma»); этиловый спирт; мурамилдипептид («Sigma»); 96-луночные круглодонные планшеты для культивирования Linbro (Flow).

Гонадэктомия. Опытным мышам проводили гонадэктомию открытым способом с использованием Zooletilтм в качестве наркоза в дозе 5 мг/кг.

Подсчет количества лейкоцитов и лимфоцитов. Для подсчета абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови 5 мкл крови разводили в 20 мкл 5%-го раствора уксусной кислоты (разведение 1:20). Определение числа лейкоцитов проводили в камере Горяева. Расчет произво-

дился по формуле

45

где Х – количество лейкоцитов в 1 мкл крови; А – количество лейкоцитов, подсчитанное в 100 больших квадратах; 20 – степень разведения крови; 1600 – количество маленьких квадратиков в 100 больших квадратах (100х16=1600); 1/4000 – объем счетной камеры(1/4000 мкл).

Для подсчета относительного количества лимфоцитов мазок крови фиксировали в спирт-эфирной смеси (1:1) 20 мин, окраску мазка крови проводили по Романовскому – Гимза.

Выделение клеток селезёнки, лимфоузлов, тимуса.

Мышей забивали дислокацией позвоночника. Обрабатывали 70%-ым этиловым спиртом и помещали на стерильный анатомический столик. В средней части делали небольшой поперечный разрез шкуры и раздвигали её по направлению к конечностям. Обнажившуюся брюшную полость вскрывали в верхней трети, тупо, при помощи пинцетов, выделяли селезёнку. Тимус извлекали путём срединного (продольного разреза) верхней части грудной клетки и вскрытия грудной полости. Селезёнку, тимус помещали во флакончики со средой, расстригали ножницами, многократно пропускали через шприц с иглой, фильтровали через металлическую сеточку и 2-3 раза отмывали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин со сменой среды. Осадок клеток селезёнки, тимуса ресуспендировали в полной среде и подсчитывали их общее количество.

Получение сыворотки крови. У мышей забор крови проводили декапитацией. Ножницами декапитировали животное, кровь собирали в пробирку.

Пробирки с кровью центрифугировали при 3000 об/мин 10 мин. Сыворотку или плазму собирали и хранили в пробирках для микропроб при температуре –20о.

Определение массы и количества ядросодержащих клеток тимуса и селезенки. Массу, общее количество клеток тимуса и селезенки определяли в динамике: через 5 и

46

12 недель после гонадэктомиии. Мышей забивали методом дислокации шейных позвонков. Массу тимуса и селезенки определяли путем взвешивания.

Количество ядросодержащих клеток тимуса и селезенки подсчитывали в камере Горяева и рассчитывали по формуле

где К1 – количество ядросодержащих клеток тимуса; К2– количество ядросодержащих клеток селезенки; А – количество клеток, подсчитанное в 100 больших квадратах; 1600 – количество маленьких квадратиков в 100 больших квадратах (100х16=1600); 1/4000 – объем счетной камеры (1/4000 мкл); 20 − степень разведения клеток тимуса; 200 – степень разведения клеток селезенки; 4,5 − объем (мл) суспензии тимуса (селезенки).

Определение уровня первичного гуморального ответа (IgM и IgG-АОК) на Т-зависимый антиген (эритро-

циты барана ЭБ). Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса M, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 5-е сутки после внутривенной иммунизации эритроцитами барана в дозе 107/ мышь по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом A.J. Cunningham (1968). У мышей после дислокации шейных позвонков извлекали селезенку и помещали в пенициллиновый флакон с 0,5 мл среды 199. Каждую селезенку помещали в отдельный флакон. Все процедуры с клетками проводили на льду. Объём клеточной суспензии доводили до 4,5 мл. Клетки разводили средой 199 в 5 раз. Затем готовили инкубационную смесь: 500 мкл суспензии селезенки, 500 мкл суспензии эритроцитов барана, 500 мкл комплемента, предварительно разведённого в 5 мл среды. Компоненты перемешивали и смесь заливали в стеклянные камеры (по 2 камеры на каж-

47

дое животное, учитывая среднее), сделанные из двух предметных стёкол, склеенных смесью воска с парафином вдоль продольных сторон. Учитывали объём камеры. Камеры помещали в термостат и инкубировали 1,5 ч при +380С. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой (увеличение х 42)

Абс.АОК kAOK Vks R Vk ,

где Абс. АОК – абсолютное количество антителообразующих клеток; kАОК – количество антителообразующих клеток на камеру;Vk – объем камеры; Vks – объем клеточной суспензии; R– разведение.

Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса G, в селезенке мышей оценивали согласно методике на пике иммунного ответа на 9-е сутки после внутривенной иммунизации 2%-м раствором эритроцитов барана (Cunningham, 1968). Объём клеточной суспензии селезенки доводили до 4,5 мл. Клетки селезенки разводили в 10 раз. Затем готовили инкубационную смесь: 700 мкл суспензии селезенки, 100 мкл суспензии эритроцитов барана, 100 мкл комплемента, предварительно разведённого в 1,5 мл среды, 100 мкл антисыворотки. Камеры, заполненные инкубационной смесью, помещали в термостат и инкубировали 2 ч при +380С. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой.

Определение вторичного гуморального ответа (IgGАОК) на Т-зависимый антиген (ЭБ). Для определения вторичного гуморального иммунного ответа проводили внутривенную иммунизацию 2%-м раствором ЭБ в дозе 0,5 мл двукратно с интервалом 30 дней. Объём клеточной суспензии селезенки доводили до 4,5 мл. Клетки селезенки разводили в 200 раз. Затем готовили инкубационную смесь: 700 мкл суспензии селезенки, 100 мкл суспензии эритроци-

48

тов барана, 100 мкл комплемента, предварительно разведённого в 1,5 мл среды, 100 мкл антисыворотки. Камеры, заполненные инкубационной смесью, инкубировали в термостате 2 ч при +380С. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой (Sterzl, Riha, 1965).

Оценка клеточного ответа на Т-зависимый антиген

(ЭБ). Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа: величины отёка лапы после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным. Для этого предварительно иммунизировали мышей внутрибрюшинно. Сенсибилизирующая доза – 0,25% ЭБ в объёме 0,5 мл (2,5x107 ЭБ/ мышь). Разрешающую дозу –50% ЭБ в объёме 50 мкл (5x108 ЭБ/ мышь) вводили под подошвенный апоневроз задней правой лапы на 4-е сутки. В контралатеральную лапу вводили среду в том же объёме. Учёт реакции проводили через 24 ч по величине местного отёка. Результаты выражали в абсолютных (разность между отёком лапки, в которую были введены ЭБ, и отёком контралатеральной лапки) и относительных единицах (отношение разности между отёком лапки, в которую были введены ЭБ, и отёком контралатеральной лапки к отёку контралатераль-

ной лапки) (Crowle, 1975).

Индукция РТПХ. Хроническую РТПХ осуществляли путём переноса самкам B6D2F1 лимфоидных клеток родительской линии DBA/2. Вводили клетки селезёнки, выделенные ex temporo, в стерильной среде RPMI-1640. Каждая мышь-реципиент получала по 150 x106 клеток путём внутривенной инъекции в хвостовую вену в объёме 0,5 мл среды двукратно с интервалом в 5 дней.

Определение белка в моче. О развитии гломерулонеф-

рита судили по стойкому появлению белка в моче. Содержание белка в моче определяли колориметрически с краси-

телем kumsai brilliant blue (Loba Feinchemie) c помощью

49

Titertec Multiskan, длина волны 570 nm; калибровочную кривую строили по BSA 100-1000 мкг/мл. На сроке от 8-й до 12-й недели после индукции РТПХ определяли протеинурию. Стойкая протеинурия (уровень белка в моче более 3мг/мл регистрировали не менее 3 раз подряд при еженедельном тестировании) свидетельствует о развитии иммунокомплексного гломерулонефрита у мышей, что коррелирует с морфологическим подтверждением болезни.

Определение IgE в сыворотке. Иммуноглобулин Е в сыворотке определяли иммуноферментным методом ELISA

(BD OptEIA ) c помощью Titertec Multiskan, длина волны

450nm.

Определение тестостерона в сыворотке. Тестостерон

в сыворотке определяли иммуноферментным методом

ELISA (ИФА-БЕСТтм) c помощью Titertec Multiskan, длина волны 450 nm.

Морфологический анализ органов мышей-гибридов

B6D2F1 как интактных, так и с РТПХ-индуцированной иммунопатологией, проводили методом обзорной микроскопии и общегистологическими полуколичественными методами совместно с сотрудниками Института клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, канд. мед. наук В.А. Логиновым и канд. мед. наук Л.А. Обуховой. Почки фиксировали в 10%-м формалине при 4оС, обезвоживали и заливали в парафин (Yoshioko et al., 1989; Muracami et al., 1995).

Статистическую обработку результатов проводили методом непараметрической статистики с использованием U-критерия Манна-Уитни (Гублер, 1978).

50