Бактерицидные свойства фагоцитов крови при сочетанной и ожоговой травмах. Учебное пособие

21

3.2. Растворимые α-дефенсины у пострадавших с ожоговой травмой

Известно, что увеличение содержания активированных нейтрофильных гранулоцитов в крови при критических состояниях сопровождается усилением лизосомальной секреции протеолитических ферментов и антимикробных пептидов, в том числе дефенсинов. Мы провели исследование содержания в крови растворимых дефенсинов у пациентов с тяжелой ожоговой травмой. Результаты исследования показали, что уже в 1- ые сутки ОжТ содержание растворимых дефенсинов было различным у пострадавших с различным исходом: у выживших пострадавших концентрация sDef была невысокой и восстанавливалась до уровня нормы через 1 сутки после инцидента, а у умерших - достоверно превышала концентрацию по сравнению с выжившими пациентами и здоровыми как при поступлении, так и через 1 сутки после травмы (рис. 3). Можно предположить, что усиление секреции антимикробного пептида лейкоцитами было обусловлено бактериемией, стимулирующим влиянием воспалительных цитокинов и медиаторов стресса.

Также выявлено, что концентрация растворимых дефенсинов в крови у пациентов с тяжелой ожоговой травмой достоверно коррелировала с поглотительной способностью НГ (фагоцитарное число r=0,471, p<0,001) и количеством активино фагоцитирующих нейтрофилов (фагоцитарный индекс r=0,471, p<0,001). Цитотоксический эффект дефенсинов наряду с бактерицидным действием может оказывать повреждающее действие как на клетки крови, так и на эндотелиоциты, усиливая сосудистую проницаемость и нарушая целостность гистогематических барьеров.

Рисунок 3. Cодержание растворимых дефенсинов мкг/мл у выживших и умерших пострадавших с ожоговой травмой

В литературе описан кортикостатический эффект дефенсинов при

22

стрессе и антигенной стимуляции, в частности, вызванной ЛПС (Кокряков В.Н. и соавт., 2006; Шамова О.В. и соавт., 2012). Мы получили данные, согласующиеся с этим положением: у пациентов с тяжелой ОжТ выявлена отрицательная корреляционная зависимость концентрации в крови sDef и кортизола (r=-0,245, p<0,05). Также выявлена отрицательная корреляционная зависимость между концентрацией sDef и содержанием противовоспалительного цитокина ИЛ-10 (r=-0,327, p<0,01).

Представленные факты могут свидетельствовать об участии противомикробного пептида дефенсина в регуляции острого воспаления и стресс-реакции при критических состояниях.

3.3. Содержание эластазы нейтрофильных гранулоцитов в плазме крови у пострадавших с сочетанной и ожоговой травмами

Воспалительная активация нейтрофильных гранулоцитов ассоциирована с усилением секреции протеолитических ферментов гранул микрофагоцитов, к числу которых относится и эластаза нейтрофилов. Если физиологические концентрации фермента призваны формировать «коридоры» для миграции клеток через сосудистую стенку, то патологическое усиление секреции эластазы вызывает нарушение проницаемости сосудистой стенки и гистогематических барьеров, обусловливающей развитие тканевых и органных повреждений, системного воспаления. Также как и плазмин, эластаза гранулоцитов осуществляет деградацию фибрина и фибриногена и таким образом оказывает фибринолитическое действие. Бактерицидное действие фермента состоит в разрушении клеточной стенки бактерий.

Упострадавших с сочетанной и ожоговой травмой содержание эластазы

всыворотке крови значительно выше нормы. У пострадавших с СТ содержание эластазы в сыворотке крови возрастает в 32 раза по сравнению с нормой уже в первые часы после травмы. У тяжелообожженных содержание эластазы максимально возрастает через сутки после травмы и превышает уровень нормы в 16 раз (рис. 4).

Усиление высвобождения эластазы нейтрофилов сочетается с развитием острого системного воспаления и нарушением проницаемости гистогематических барьеров, о чем свидетельствует положительная корреляционная связь между концентрациями в крови эластазы и провоспалительного цитокина ИЛ-6 (r=0,609) и эластазы и нейроспецифического белка S-100b (r=0,447, p<0,05).

Рисунок 4. Содержание эластазы НГ (нг/мл) у пострадавших с сочетанной и ожоговой травмой

3.4. Хемилюминесценция нейтрофильных гранулоцитов у пострадавших с сочетанной и ожоговой травмами

Известно, что в остром периоде сочетанной травмы наблюдается усиление уровня ХЛ, как спонтанной, так и индуцированной (Арискина О.Б. и соавт., 2005). Продукция активных форм кислорода (АФК) обеспечивает своевременную элиминацию инфекционных агентов и токсинов, приводит к преодолению травматического токсикоза. Гипоили гиперпродукция АФК способствует развитию инфекционных осложнений. Избыточная продукция оксидантов на фоне недостатка их инактиваторов повышает уровень внутриклеточных аутоокислительных процессов, ослабляя антимикробные свойства фагоцитов (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989).

У пострадавших с сочетанной травмой в остром периоде травматической болезни показана активация спонтанной и индуцированной хемилюминесценнции гранулоцитов крови как показателя усиления их бактерицидных свойств и развития острой воспалительной реакции (рис. 5).

У пострадавших с ожоговой травмой при поступлении на фоне нейтрофилеза (до 18,7·109/л) отмечено усиление как спонтанной, так и индуцированной оксидантной активности НГ (Пивоварова Л.П. и соавт., 2015) (рис. 6). В отличие от пациентов с сочетанной травмой, выраженная активация хемилюминесценции микрофагоцитов при ожоговой травме наблюдалась только при поступлении.

Хемилюминесценция цельной крови и, особенно, нейтрофильных гранулоцитов, как исключительно индуцибельная реакция, позволяет

25

переваривающая способность. Нейтрофильные гранулоциты крови обладают выраженной фагоцитарной активностью и участвуют в острой воспалительной реакции. Главная их функция – фагоцитоз опсонизированных микроорганизмов.

Упострадавших с СТ и ОжТ оценивали эффективность фагоцитоза, определяя число НГ, фагоцитирующих опсонизированные гранулы зимозана

–фагоцитарный индекс (ФИ%) и среднее число поглощенных объектов фагоцитоза одной клеткой – фагоцитарное число (ФЧ) через 30 и 60 минут инкубации суспензии лейкоциты в присутствии зимозана при 37ºС (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990).

Упострадавших с тяжелой ожоговой травмой (индекс Франка более 90 у.е.) наблюдали тенденцию к увеличению количества фагоцитирующих лейкоцитов (ФИ увеличен как через 30, так и 60 минут инкубации). Интенсивность поглощения объектов фагоцитоза фагоцитами была снижена у пациентов с неблагоприятным исходом ожоговой травмы (рис. 7).

норма выжившие умершие

Рисунок 7. Поглотительная способность НГ у выживших и умерших пострадавших с ожоговой травмой

Соотношение количества поглощенных частиц внутри фагоцитов через 30 и 60 минут после начала инкубации клеточной суспензии с частицами зимозана отражает эффективность внутриклеточной деградации объектов фагоцитоза под действием внутриклеточных антимикробных факторов и называется «коэффициент деградации» (КД). Чем ниже его величина, тем эффективнее фагоцитоз. У всех пострадавших с ОжТ эфективность фагоцитоза была снижена (КД увеличен) и в большей степени - у пациентов с крайне тяжелой ожоговой травмой (ИФ 123 (111; 131) у.е.) (рис. 8).

При сочетанной травме, также, как и при ожоговой, поглотительная способность нейтрофильных гранулоцитов снижена по сравнению с нормальными величинами, что является одним из факторов недостаточной эффективности фагоцитоза. Снижение поглотительной способности

26

фагоцитов у пострадавших (при инкубации клеток с объектами фагоцитоза в течение 30 и 60 минут) наблюдали при поступлении, через 3, 10 и 30 суток после травмы (Пивоварова Л.П., 1999) (рис. 9).

Рисунок 8. Коэффициент деградации объектов фагоцитоза (усл. ед.) у выживших и умерших пострадавших с ожоговой травмой

Рисунок 9. Поглотительная способность НГ через у пострадавших с сочетанной травмой

В то же время количество НГ, участвующих в фагоцитозе, у пострадавших с СТ оставалось близким к нормальным величинам (ФИ 30

мин 68 (66;75) %; ФИ 60 мин 74 (72;80) %.

Таким образом, при сочетанной и ожоговой травмах количество фагоцитирующих нейтрофильных гранулоцитов сохраняется в достаточном количестве или увеличивается, но их поглотительная способность снижается, что создает дополнительный риск развития бактериальных осложнений.

27

5. СОДЕРЖАНИЕ В КРОВИ ЦИТОКИНОВ, ОКАЗЫВАЮЩИХ РЕГУЛИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ НА ФУНКЦИИ ФАГОЦИТОВ КРОВИ

Тяжелая сочетанная и ожоговая травмы сопровождаются потерей клеточных элементов крови в результате кровопотери или гибели ее клеток при воздействии внешних повреждающих факторов (токсических, термических). Воспроизводство клеток крови в течение нескольких часов может быть увеличено в 10-12 раз (Луговская С.А., 2014) и регулируется гемопоэтическими факторами, основной биологической функцией которых является стимуляция пролиферации и дифференцировки различных типов клеток-предшественников в костном мозге.

Гемопоэз непрерывно поддерживается пулом стволовых кроветворных клеток активация пролиферации и миграции которых из костного мозга инициируется ростовыми факторами и цитокинами. При неотложных состояниях важными индукторами миелопоэза являются воспалительные цитокины, в частности, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, Г-КСФ. Первоначально СКК воспринимают короткодистантные стимулы при межклеточном контакте и по мере дифференцировки реагируют на дальнодействующие гуморальные факторы. Основными продуцентами цитокинов и ростовых факторов выступают активированные моноциты, макрофаги, лимфоциты, дендритные клети, фибробласты, эпителиальные и эндотелиальные клетки, а в качестве активирующих факторов клеток выступают микробные антигены и антигены поврежденных тканей. Выделяют позитивные и негативные регуляторы гемопоэза (табл.2).

Таблица 2 - Регуляторы гемопоэза

В зависимости от уровня дифференцировки клеток-эффекторов факторы регуляции гемопоэза делят на 3 основных класса (Луговская С.А., 2014) (табл.3):

* - коммитированные, или унипотентные, клетки-предшественницы, неизбежно дифференцирующиеся только по одной линии.

Реакция организма на стресс при неотложных состояниях сопровождается немедленно развивающимися гиперкортизолемией и гиперцитокинемией с увеличением концентраций как воспалительных, так и противовоспалительных цитокинов, что разнонаправлено влияет на миелопоэз и функциональные характеристики микрофагоцитов. В результате в остром периоде сочетанной и ожоговой травмы наблюдается лейкоцитоз, нейтрофилез с увеличением относительного содержания ранних форм развития нейтрофильных гранулоцитов (в том числе метамиелоцитов и миелоцитов) (Пивоварова Л.П., 1999; Малышев М.Е., 2014; Пивоварова Л.П.

и соавт. 2015).

5.1. Содержание гранулоцитарного колониестимулирующего

фактора в крови пациентов с тяжелой ожоговой травмой

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор представляет собой полипептид с м.м.18,6 кДа. Основными индукторами синтеза Г-КСФ являются антигены грам(-) и грам(+) бактерий и провоспалительные цитокины ИЛ-1β и ТНФ. Г-КСФ синтезируется в организме многими типами клеток, включая моноциты, макрофаги, фибробласты, стромальные клетки, эндотелиоциты (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). Продукция Г-КСФ начинается локально в ответ на внедрение инфекционных агентов, затем цитокин поступает в кровоток и достигает костного мозга, где взаимодействует с рецепторами Г-КСФ на клетках миелоцитарного ростка кроветворения от миелобластов до зрелых нейтрофильных гранулоцитов.

29

Число рецепторов колеблется от 50 до 500 на клетку и, по мере созревания нейтрофилов, количество рецепторов возрастает.

Биологическое действие Г-КСФ направлено на стимуляцию пролиферации, дифференцировки и созревания костномозговых предшественников нейтрофильных гранулоцитов. Г-КСФ также усиливает хемотаксис (направленную миграцию) нейтрофилов. Зрелые гранулоциты мигрируют из костного мозга в кровь, а затем и в область поражения, где под влиянием тканевых и бактериальных антигенов, медиаторов воспаления, в том числе и Г-КСФ, продуцируют кислородные радикалы и антимикробные пептиды. Эти процессы связаны с усилением экспрессии нейтрофилами адгезионных молекул, высокоаффинных рецепторов для Fc-фрагментов иммуноглобулинов класса G, активацией синтеза щелочной фосфатазы и продуктов метаболизма арахидоновой кислоты (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008).

В то же время, под влиянием Г-КСФ уменьшается ЛПСиндуцированная продукция провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ТНФ (Bonederg E. et al., 2000) и происходит усиление синтеза рецепторного антагониста ИЛ-1 (IL1-RI) и увеличение концентрации в плазме растворимых рецепторов (sIL1-R) (Hartung T. еt al., 1995), блокирующих воспалительные эффекты ИЛ-1β.

Также Г-КСФ является цитокином, стимулирующим Т-хелперы 2 типа. Активация Т-хелперов 2 типа сопровождается усилением продукции ИЛ-4 (Sloand E. et al., 2000) и ИЛ-10 (Rutella S. et al., 1999), что ведет к развитию гуморального ответа, в результате которого формируется специфическая защитная реакция на внедрение бактерий (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Симбирцев А.С., 2018). Активация дендритных клеток под влиянием Г- КСФ также стимулирует Т-хелперы 2 типа (Arpinati M. et al., 2000). В то же время, под влиянием Г-КСФ снижаетя продукция ИФНγ (Bonederg E. еt al., 2000г.) и ИЛ-12, что отражает ограничение активности Т-лимфоцитов I типа (Т-клеток воспаления).

Выполненные нами исследования показали, что у пострадавших с тяжелой ОжТ содержание Г-КСФ возрастает в 1-3 сутки после травмы в 1416 раз (рис.10). При этом выявлена корреляционная зависимость между концентрацией Г-КСФ и количеством палочкоядерных гранулоцитов (r=0,569; р<0,05), а также - содержанием хемокина ИЛ-8 в крови (r=0,465;

р<0,05).

При гнойной инфекции, в том числе при сепсисе, уровень эндогенного Г-КСФ в плазме крови значительно повышен и коррелирует с выраженностью инфекционного процесса. По данным Presneil J. еt al. (2000), уровень Г-КСФ не является прогностическим критерием смертности и развития полиорганной недостаточности.

норма выжившие умершие

Рисунок 10. Содержание Г-КСФ (пг/мл) в крови выживших и умерших пострадавших с тяжелой ожоговой травмой

5.2. Интерлейкин-8 - фактор, активирующий нейтрофильные гранулоциты

Интерлейкин-8 (хемокин CXCL8) относится к семейству провоспалительных хемокинов, главным биологическим действием которого является индукция направленной миграции (хемотаксиса) и дегрануляции лейкоцитов. Основными продуцентами ИЛ-8 являются активированные моноциты, лимфоциты, эндотелиальные и тучные клетки (Симбирцев А.С., 2018, Dunican A. еt al., 2000). Эндотелиальные клетки сохраняют во внутриклеточных гранулах преформированный ИЛ-8, что обеспечивает его более быструю секрецию после активации клеток по сравнению с синтезом белка de novo, требующим 2-3 часа. ИЛ-8 определялся в крови добровольцев уже через 10-15 минут после введения ЛПС (Wolff B. еt al., 1998). Быстрый выброс хемокина активированными клетками ведет к запуску нового синтеза ИЛ-8 этими же клетками с усилением экспрессии рецепторов цитокина клетками-мишенями, активацией воспаления и блокированием апоптоза. Экспрессия гена и синтез ИЛ-8 индуцируются многими бактериями, вирусами, простейшими и их структурными компонентами. ЛПС вызывает интенсивную продукцию ИЛ-8 (Suzuki T. et al., 2000). Из литературы известно, что м-РНК ИЛ-8 определяется в клетках через 1 час после начала активации, достигая максимального уровня через 3 часа (Matsuzaka T. et al., 1993).

Также индукторами синтеза ИЛ-8 являются провоспалительные цитокины, которые синтезируются в ответ на воздействие патогена: ИЛ-1β, ТНФ, ИФНγ, ГМ-КСФ и другие.