ТЕМА: «ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ»

Цель: сформировать представление о строении вирусного генома, видах изменчивости вирусов и селекции.

План

1.Структура вирусного генома.

2.Генетические признаки вирусов.

3.Изменчивость вирусов и селекция.

1. Структура вирусного генома

Наследственные признаки очень стойкие и передаются из поколения в поколение от родителей к потомкам через материальные носители наследственности – нуклеиновые кислоты.

Но в то же время организмы в мире не изолированы, а взаимосвязаны с внешней средой и другими организмами. И под влиянием этих факторов происходят изменения отдельных признаков в организмах как на генетическом уровне (наследственная изменчивость), так и не связанные с изменением генетического аппарата (не наследственная изменчивость).

Наследственность и изменчивость тесно связаны между собой и являются противоположными сторонами единого процесса эволюции живых существ. Следует отметить, что вирусы в значительной мере способствовали развитию генетики как науки, так как они являются удобной моделью для изучения состава, репликации, функций нуклеиновых кислот, явлений изменчивости, что связано с простым строением и быстрым размножением (репродукция).

В развитии биологии, в том числе и вирусологии и генетики, важную роль сыграли такие открытия, как расшифровка структуры молекулы ДНК, расшифровка синтеза белка, расшифровка генетического кода.

Эти открытия сравнивают с открытием атомной энергии иХХвекназываютвекомбиологии всвязистем,чтобылираскрыты интимные стороны жизни – тончайшее строение и функции нуклеиновых кислот.

20

Долгое время считалось, что носителем наследственной информации является белок. Но в 1944 г. Эвери доказал, что трансформации бактерий обусловлены нуклеиновой кислотой. В вирусологии значение нуклеиновой кислоты как носителя информации доказали Хергии и Чейз в 1952 году. Они заметили, что заражение бактерий может вызвать фаг, лишенный белковой оболочки. Функцию вирусного генома выполняет или ДНК, или РНК. ДНК или РНК могут быть одноили двухцепочные.

Геном вирусов может быть представлен 10 вариантами: одноцепочная нефрагментированная РНК + цепью, т.е. выполняет

роль информационной РНК (пикорна- и тогавирусы, ретровирусы); одноцепочная нефрагментированная РНК-цепь (рабдо-, пара-

миксовирусы); одноцепочная фрагментированная РНК-цепь (ортомиксовирусы);

одноцепочная фрагментированная кольцевая РНК (бунъя вирус); двухцепочная фрагментированная РНК (реовирусы); одноцепочная ДНК нефрагментированная (парвовирусы); одноцепочная ДНК циркулярная (цирковирусы); двухцепочная ДНК н фрагментированная (герпес-, аденовирусы); двухцепочная ДНК кольцевая (папиломавирусы).

Как и в любой другой генетической системе, в наследственном аппарате вирусов используется триплетный код. Три нуклеотида в одноцепочных молекулах или три пары нуклеотидов в двух цепочных молекулах нуклеиновых кислот кодируют одну аминокислоту. Они называются «кодоны».

Соединяясь между собой в определенной последовательности, триплеты образуют генетический код. Но количество возможных вариантов кодонов (64) превышает количество аминокислот (21). Это значит, что на каждую аминокислоту приходится 2–3 кодона для страховки, исключение – триптофан и метионин они кодируется одним триплетом. Нуклеиновая кислота вирусов состоит из участков отличающихся друг от друга определенной последовательностью и количеством триплетов – эти участки называют генами и каждый ген ответственен за синтез одного определенного белка. Число генов в нуклеиновой кислоте у разных вирусов варьирует в широких пределах. Например, вирус ящура и гриппа имеют по 3–5 генов у вируса полиоэмилита 10, а у вируса ньюкаслской болезни – 37, вируса оспы – 400 генов, а у человека – 10 млн.

21

2. Генетические признаки вирусов

Генетические признаки – это любые наследственно передаваемые свойства, которым можно дать качественную и количественную оценку

икоторые проявляются в определенных условиях среды. Вирусы обладают определенными генетическими признаками, совокупность которых составляет генотип вируса, а совокупность проявленных генетических признаков составляет фенотип вируса. Изучение генетических признаков вирусов имеет большое практическое значение, как в теоретическом, так и в практическом отношении. По этим признакам вирусы классифицируются, отбираются необходимые штаммы. Эти признаки или свойства используют в диагностической и лечебно-профилактиче- ской работе. Но генетические признаки вирусов изучены недостаточно полно, т. к. не все признаки, заложенные в генотипе, могут проявиться в конкретных условиях. И еще это связано с неоднородностью генотипов вирусных частиц в одной популяции. Генетические признаки вирусов условно разделяют на: групповые, видовые и штаммовые. Групповые признаки – это тип нуклеиновой кислоты, тип симметрии, размер

иморфология, тип капсидной оболочки, количество капсомеров, наличие суперкапсидной оболочки, устойчивость к жирорастворителям или наличие липидов, антигенная специфика. Видовые признаки – патогенность для того или иного вида животного, тропизм, устойчивость к кислотности среды (рН), способность к гемагглютинации, характер ЦПД. Штаммовые (внутривидовые) признаки – вирулентность для животных

икуриных эмбрионов, терморезистентность, гемагглютинирующая активность, антигенная активность, характер бляшек, устойчивость к различным химическим и физическим факторам.

Каждый генетический признак вируса принято обозначать латинскими буквами. Терморезистентность – Tr, термочувствительность – Ts, температура размножения rct — 40°, патогенность S, инфекционная доза – ИД 50, способность размножаться в культуре клеток, вызывая ЦПД – ТС, устойчивость к рН среды – РН.

3.Изменчивость вирусов и селекция

Впроцессе репродукции вирусов в потомстве могут появляться вирионы, отличающиеся по своим свойствам от исходных

22

родительских. Изменения могут касаться величины, формы патогенности, антигенной структуры, тропизма. Вновь возникшие свойства могут быть наследуемые, т.е. связанные с изменениями в геноме вируса (генетические), или ненаследуемые, т.е. не связанные с изменениями в геноме вируса (фенотипические).

Фенотипическая форма изменчивости или негенетическая связана с особенностями клетки хозяина, в которой происходит репродукция. У вирусов позвоночных изменения связаны прежде всего со строением суперкапсида, который формируется на оболочках клетки. Поэтому при образовании оболочки включаются клеточные липиды, белки, углеводы. Так, в оболочку вируса гриппа, культивированного на куриных эмбрионах, встраиваются белки аллантоиса.

Кфенотипическим формам изменчивости относят и негенетические взаимодействия вирусов между собой, это фенотипическое смешивание; негенетическая реактивация; комплементация.

Фенотипическое смешивание происходит при заражении клетки двумя разными вирусами, при этом потомство приобретает признаки обоих вирусов. Например, при заражении вирусом гриппа

ивирусом нъюкаслской болезни. При этом в потомстве выявляются вирионы, содержащие антигены и вируса гриппа, и вируса нъюкаслской болезни.

Негенетическая реактивация (восстановление активности). При этом инактивированный вирус, у которого разрушены белки – ферменты, необходимые для репродукции, способен репродуцироваться за счет фермента у другого вируса, даже у которого поврежден геном.

Комплементация – это когда белки, кодируемые геномом одного вируса, способствуют репродукции другого вируса. Например, предоставление фермента вирусу, у которого его нет. Таким образом, комплементация приводит к формированию полноценного вириона, но она происходит только между близкородственными вирусами. Комплементация может быть односторонняя, когда один вирус обеспечивает другого необходимыми продуктами для репродукции. Двухсторонняя, когда каждый из вирусов не способен к самостоятельной репродукции.

Кнаследственно закрепленным формам изменчивости относят мутации и генетические взаимодействия вирусов. Причинами

23

сравнительно высокой способности вирусов к этому виду изменчивости являются огромная численность популяции вирусов, высокая скорость репродукции, слабая защищенность нуклеопротеида от внешних воздействий.

Мутация – это изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома вируса. В основе мутаций лежат следующие процессы:

1.Инверсия – изменение последовательности расположения одного или нескольких нуклеотидов (КОТ-ТОК). Аналогично тому, как меняется смысл вновь полученного слова, так и меняется состав гена, а значит при синтезе получится другой белок и другие свойства

увируса.

2.Замена одной или нескольких пар нуклеотидов другими (КОТ-КОМ).

3.Вставки–вцепьвстраиваетсяодинили нескольконуклеотидов (ОКО-ОКНО).

4.Делеция – выпадение из цепи одного или нескольких нуклеотидов (ОКНО-ОКО).

5.Дупликация – дублирование одного или нескольких нуклео-

тидов.

По обратимости необратимые, при которых изменяется фенотип вируса, и такие мутанты быстро вытесняют другие популяции вируса.

Обратимые мутации, при которых происходит обратная мутация в месте первичной.

По протяженности мутации могут быть точечными, захватывать лишь один триплет. Такие мутации могут не проявляться за счет того, что одна аминокислота кодируется несколькими кодонами. Могут быть аберрационными, которые захватывают значительный участок гена. Такие мутации проявляются всегда.

По природе мутации бывают спонтанные и индуцированные. Спонтанные – самопроизвольные, возникают в природе при воздействии на геном вируса различных естественных мутагенных факторов или ошибок действия ферментов ДНК-полимеразы или РНК-полимеразы. Одной из важных причин, приводящих к изменению вирусов в естественных условиях, является коллективный иммунитет, который препятствует дальнейшему размножению вируса,

24

вызвавшего инфекцию (спад эпизоотии). В иммунном организме могут репродуцироваться антигенные варианты этого вируса, которые не обезвреживаются специфическими антителами. Следовательно, в процессе эпизоотии выживают вирионы с измененной антигенной структурой, которые впоследствии после селекции образуют новую популяцию вируса, способную инфицировать иммунный организм. Хорошо известна естественная изменчивость вируса гриппа, который проявляется появлением различных антигенных вариантов вируса. Способствующим фактором является фрагментированная РНК. В результате мутации и рекомбинации между вирусами гриппа человека и животных образуются новые варианты вируса.

Вирус ящура имеет 7 типов, а внутри десятки вариантов и в ходе эпидемии происходит смена типов и вариантов, что затрудняет специфическую профилактику болезни.

Помимо антигенной изменчивости может наблюдаться изменчивость патогенных свойств – повышение или понижение вирулентности. Например, вирус ньюкаслской болезни сначала вызывал смертельное заболевание птицы. В настоящее время регистрируют легкое течение данной болезни. Такой вирус называется природноослабленный штамм и используется для приготовления вакцины. К сожалению, бывают и противоположные факты: усиление вирулентности вируса в природных условиях (так произошло с вирусом бешенства и вируса миксоматоза кроликов).

Индуцированные (искусственные) мутации возникают в результате направленных воздействий экспериментатора на вирус различными физическими и химическими мутагенами, а также при адаптации вируса к необычной биосистеме. Такое воздействие на вирус вызывают мутации в десятки и сотни раз эффективнее, чем природные факторы. Действие мутагенов имеет определенную направленность, что позволяет заранее предвидеть, куда действует мутаген и какие последствия вызовет. Существуют физические, химические мутагены.

Физические мутагены: повышенная температура способствует удалению пуринов из ДНК и замене другими; УФО – поглощается нуклеиновой кислотой, изменяет структуру пиримидинов.

Химические мутагены могут действовать на нуклеиновую кислоту во время ее репликации (аналоги пуриновых и пиримидиновых

25

оснований) или вступать в реакцию с покоящейся молекулой нуклеиновой кислоты, но требующей для выявления (формирования) мутаций последующей ее репликации (азотистая к-та, гидроксиломин) и т.д.

Процесс адаптации вируса к нечуствительной живой системе происходит таким образом. Вирусом заражается нечувствительная живая система. В первых пассажах вируса на такой живой системе большинство вирионов погибает. Остаются и размножаются только те вирионы, у которых есть изменение в генах. Эти изменения позволяют им репродуцироваться в новой для них системе. Так как вируса очень мало, то какие-либо признаки размножения вируса не проявляются. После нескольких «слепых» пассажей количество вирионов, способных размножаться в необычных условиях, увеличивается до такой степени, что появляются признаки размножения вируса. В результате появляется популяция вируса, способная «размножаться» на нечувствительной живой системе. Обычно в то же время патогенность к чувствительной системе понижается. Пример: лапинизированный вирус ящура стал патогенен для кроликов, а патогенность для КРС у него снизилась. Пастер (1822–1895) ослабил вирус бешенства, пассируя через организм кролика.

Рекомбинация – это обмен генетическим материалом между двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусами. Рекомбинации могут быть межгенными – обмен полными генами и внутригенными – обмен участками генов. Образующийся рекомбинантный вирус приобретает свойства обоих вирусов. Рекомбинанты вирусов получаются только при скрещивании близких по свойствам родственных вирусов. Рекомбинации могут происходить толькомеждуодноцепочнымиидвухцепочныминуклеиновымикислотами. В экспериментальных условиях гибридные (рекомбинантные) формы можно получить при совместном введении в клетку двух жизнеспособных вирусов или живого и инактивированного вируса или живого вируса и вирусной нуклеиновой кислоты, выделенной из другого штамма или одновременно двух нуклеиновых кислот от разных вирусов.

Таким образом, получают гибриды с признаками, не встречающимися в природе. Так, в результате гибридизации инактивированного УФ-лучами вируса гриппа типа А, образующего бляшки,

26

с инфекционным вирусом гриппа, не обладающим такой способностью, получили бляшкообразующий инфекционный вирус. Открыты гибридизации между вирусами гриппа животных и человека, ящура

иреовирусов.

Кгенетическим взаимодействиям вирусов относят также множественную реактивацию (восстановление активности), которая наблюдается при заражении клетки несколькими вирионами с поврежденным геном. При этом функцию поврежденного гена выполняет вирус, у которого этот ген не поврежден. Таким образом, вирионы дополняют друг друга путем генных рекомбинаций, и в результате репродуцируется неповрежденный вирус.

Кросс-реактивация сходна с предыдущей, но отличается тем, что один вирус используют неизменным, а другой инактивируют. При этом наблюдается восстановление активности инактивированного генома геномом неповрежденного вируса.

Пересортировка генов наблюдается среди вирусов с фрагментированным геномом. При этом образуются группировки генов, которые позволяют более благоприятно жить вирусу в данной биосистеме.

Гетерозиготность наблюдается случае репродукции в клетке вирионов, отличных по генетическим признакам. При этом потомство может обладать частично свойствами одного, частично другого родителя ичастично смешаннымисвойствами (вирус гриппа и вирус болезни Нъюкасла).

Транскапсидация выявлена при репродукции в клетке нескольких неродственных вирусов. При этом вирусный геном, неспособный синтезировать белки капсида, прикрепляется в неизменном виде к геному другого вируса и «переезжает» с ним в другую клетку.

Популяции вирусов в результате генетических взаимодействий: рекомбинаций,пассажейиливоздействиямутагеновгенетическинеодинаковы. В общей массе мутированных есть вирионы, которые не изменились или реверсировали (восстановили свои свойства). В результате дальнейшей репродукции (за счет них) популяция вирусов может восстанавливать свои первичные свойства. Поэтому проводят селекцию вирусов, используя различные методы отбора вирионов

исоздание однородной популяции.

27

Для «очистки» мутантов прибегают к клонированию, т.е. получение популяции из одного отдельного вириона (чистая линия).

Методы селекции:

–Выделение культуры вируса из отдельных бляшек на ХАО куриного эмбриона или на культуре клеток. Так как считается, что 1 бляшка – это потомство 1 вириона.

–Метод предельных разведений. Вирус разводят до 1 вириона в определенном объеме культуральной жидкости и этой дозой заражается культура клеток или куриный эмбрион. В результате получается популяция из одного вириона.

–Метод избирательной адсорбции и элюции. Вирусную суспензию смешивают с сорбентом, на который прилипают только измененные вирионы. Затем сорбент с вирионами отмывают, а вирионы снимают с сорбента.

–Метод пассажей в измененных условиях культивирования. Вирус продолжают культивировать в нечувствительной живой системе в течение 100–200 пассажей. За это время остаются только измененные вирионы, которые уже не смогут восстановить свои первоначальные патогенные свойства, даже если их ввести в бывшую чувствительную систему.

28