Как происходит процесс гибридизации и исследования в целом?

1. На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда должен быть достаточно большим для того, чтобы гибридизация происходила по специфическому сайту, но и не слишком большим, чтобы не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических локусов или при окраске целых хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченых ДНК повторов. Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.

2. На следующем этапе приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70 °C.

3. Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов.

4. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

5. Следующим этапом проводят при помощи флуоресцентного микроскопа визуализацию связавшихся ДНК-зондов. Интенсивность флуоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флуоресцентного красителя.

6. Далее врач-генетик анализирует полученные результаты и делает выводы.

Какие преимущества и недостатки есть у fish-анализа?

Некоторые плюсы метода FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) в генетике:

• Метод имеет высокую точность при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.

• Он даёт возможность оценить генетический статус отдельной клетки и выявить, например, несколько аномальных клеток среди тысяч других с нормальным генотипом.

• FISH-анализ позволяет обнаружить хромосомные аномалии (микроделеции), не выявленные с помощью кариотипирования или ПЦР.

• Благодаря этому методу можно проводить исследование не только на метафазных ядрах, но и на неделящихся (интерфазных) клетках. Это делает тест более точным и информативным для определения хромосомных изменений в тканях с низкой пролиферативной активностью, например, в опухолях значительных размеров.

К сожалению, у метода FISH имеются и недостатки, а именно:

• Специфичность зондов только к одному участку генома. Как следствие, при одном исследовании можно определить наличие или число копий только этого участка (или нескольких при использовании многоцветных зондов).

• Для проведения анализа необходимы дорогостоящее оборудование, дорогие расходные материалы, что влечёт за собой высокую стоимость исследования.

Подводя итоги…

FISH-анализ может быть нужен людям при подозрении на наличие злокачественного заболевания крови или солидных опухолей, тактика лечения и прогноз которых зависит от хромосомного состава опухолевого клона.

FISH-тест часто проводят в сочетании с другими методами молекулярной и цитогенетической диагностики. Результат этого исследования оценивают в комплексе с результатами дополнительных лабораторных и инструментальных данных.

Пациенты отмечают, что метод обладает высокой точностью (чувствительность и специфичность составляют более 90%) и помогает подобрать оптимальную противоопухолевую терапию.

На этом всё, спасибо за внимание.