5 курс-20251107T185252Z-1-001 / Война / Тема 37 / Биологическая индикация радиационного воздействия на организм человека с использованием цитогенетических методов

Федеральное Государственное Учреждение

«Российский научный центр рентгенорадиологии

Федерального агентства по высокотехнологичной

медицинской помощи»

Институт Общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Биологическая индикация радиационного

воздействия на организм человека с

использованием цитогенетических методов

Медицинская технология №ФС-2007/015-У

Москва 2007

АННОТАЦИЯ

Представлена усовершенствованная медицинская технология цитогенетического обследования лиц, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения в результате профессиональной деятельности или радиационных аварий. Представлены возможности использования цитогенетических методов для оценки уровня облучения людей, как в ранние сроки, так и в отдаленном периоде после радиационного воздействия.

Медицинская технология предназначена для врачей-лаборантов, врачей-генетиков. Медицинская технология может быть использована в центрах медицины катастроф (федеральных, региональных, территориальных), в диагностических центрах, в центрах государственного санитарно-эпидемиологического надзора в субъектах Российской Федерации и Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем

Минздрава России.

Учреждение ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии разработчик Росмедтехнологий», 117997, ГСП-7, Москва, ул. Профсоюзная, д.86

Соразработчик: Институт Общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д.3

Разработчики:

Снигирева Г.П. - ведущий научный сотрудник отдела радиационной медицины РНЦРР,

кандидат биологических наук Богомазова А.Н. - биолог отдела радиационной медицины РНЦРР, кандидат биологичес-

ких наук Новицкая Н.Н. - инженер-химик отдела радиационной медицины РНЦРР

Хазинс Е.Д. - инженер-программист отдела радиационной медицины РНЦРР Рубанович А.В. - заведующий лабораторией радиационной генетики ИОГен РАН,

доктор биологических наук

Рецензенты:

Домрачева Е.В. - руководитель кариологической лаборатории ФГУ ГНЦ РАМН, доктор медицинских наук, профессор;

Федоренко Б.С. - руководитель лаборатории радиобиологии ФГУ ГНЦ РФ – ИМБП РАН, доктор биологических наук

4

ВВЕДЕНИЕ

В профессиональных условиях работы с источниками ионизирующих излучений возможно возникновение нештатных ситуаций, когда определение поглощенной дозы с помощью физической дозиметрии может быть ограничено или невозможно. В этих случаях могут быть применены биологические методы дозиметрии, которые позволяют оценить суммарный эффект от воздействия радиации с учетом индивидуальных особенностей облученного организма. Такая информация имеет, несомненно, большое значение для оказания своевременной эффективной помощи в случае острого радиационного воздействия, а также для прогностической оценки возможных отдаленных последствий облучения.

Наибольшее распространение получили методы биодозиметрии, основанные на анализе частоты радиационно-индуцированных генетических изменений в соматических клетках – геномных, хромосомных или генных мутаций. Одним из самых разработанных и обоснованных является цитогенетический метод, при котором в качестве биологического маркера облучения используются хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови. Материалы многочисленных отечественных и зарубежных цитогенетических исследований послужили основой для выработки рекомендаций ВОЗ,

МАГАТЭ, НКДАР ООН по практическому использованию данного метода при определении доз облучения (WHO, 1976; UNSCEAR, 1982; IAEA, 1986).

Радиобиологической основой для применения цитогенетического метода в дозиметрии является высокая чувствительность лимфоцитов периферической крови, а

также наличие специфичных для радиации хромосомных перестроек, дозовая зависимость частоты которых для большинства видов ионизирующих излучений хорошо изучена. Под воздействием радиации могут возникать два типа хромосомных аберраций: нестабильные

(дицентрики, центрические кольца, ацентрические фрагменты) и стабильные

(реципрокные и другие типы транслокаций). Чаще всего для оценки величины поглощенной организмом дозы используют частоту возникновения обменных аберраций нестабильного типа, а именно, дицентрических хромосом. Преимущество дицентриков состоит в том, что аберрации данного типа являются специфичными для воздействия ионизирующих излучений, их легко обнаружить в световом микроскопе без применения сложных методов обработки и окрашивания хромосомных препаратов. Однако следует иметь в виду, что клетки, несущие такие аберрации, образуют при делении генетически несбалансированные клетки, что в дальнейшем приводит к их элиминации. Поэтому успешное применение нестабильных аберраций для определения дозы облучения в

5

основном возможно в ранние (до 3 - 4 месяцев) сроки после однократного, относительно равномерного радиационного воздействия. В случае хронического облучения и при ретроспективной оценке дозы радиационного воздействия необходимо применение различных математических моделей, учитывающих либо процесс элиминации подобных клеток из кровотока, либо особенности распределения аберраций по клеткам

Определить степень радиационного поражения организма, а также оценить дозу облучения спустя длительное время после радиационного воздействия или в случае хронического облучения можно с помощью стабильных хромосомных аберраций (транслокаций) в лимфоцитах периферической крови. Это возможно благодаря тому, что такие повреждения хромосом не нарушают течения митоза и могут передаваться в ряду клеточных поколений, то есть частота транслокаций не должна подвергаться значительным изменениям со временем.

В последние годы для определения частоты стабильных хромосомных аберраций (транслокаций) широко используют новый молекулярно-генетический метод – FISH (fluorescence in situ hybridization), который позволяет визуализировать отдельные хромосомы или участки хромосом. Он основан на флуоресцентном окрашивании хромосом или отдельных участков хромосом после гибридизации in situ с использованием хромосомо-специфичных ДНК-зондов. В препаратах метафазных хромосом, окрашенных с помощью FISH метода, структурные нарушения легко распознаются, поэтому скорость анализа препаратов значительно выше, чем при использовании дифференциального окрашивания, и, кроме того, не требуется долгое обучение исследователя.

Показания к использованию медицинской технологии

Возможное радиационное воздействие на организм человека в результате различных

чрезвычайных и аварийных ситуаций.

Противопоказания к использованию медицинской технологии

Противопоказаний к применению метода нет.

Материально-техническое обеспечение медицинской технологии

Для осуществления медицинской технологии используется стандартный комплект оборудования и реактивов для проведения цитогенетического обследования, согласно приказу МЗ РФ № 316 от 30.12.1993 г.

6

колхицина в культуральной среде должна быть не более 0,25 – 0,40 мкг/мл, колцемида –

0,1–0,2 мкг/мл. Такие количества блокирующего вещества позволяют получить достаточное количество метафаз без заметного токсического эффекта, который может иметь место при более высоких концентрациях. Удобным для использования является раствор колцемида в физиологическом растворе с концентрацией 5 мкг/мл. Стерильно приготовленный раствор колцемида можно хранить при t=4оС в течение нескольких месяцев. Через 45 часов от начала культивирования 0.15 мл такого раствора добавляют в каждый флакон, культуру клеток перемешивают и оставляют в термостате при t=37оС на 3

часа.

По окончании инкубации с колцемидом (или колхицином) тщательно

перемешивают содержимое флаконов и переливают в 15 мл центрифужные пробирки.

Дальнейшая обработка клеточной суспензии проходит при комнатной температуре.

Пробирки центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5-8 мин для осаждения клеток.

Затем пастеровской пипеткой или при помощи водоструйного насоса отбирают супернатант, оставляя около 0,5 мл надосадочной жидкости. Осадок из клеток ресуспендируют в 8-10 мл гипотонического раствора, предварительно нагретого до 37оС.

В качестве гипотонического раствора можно использовать 0,56% раствор хлористого калия; раствор, содержащий равные количества 0,56% раствора хлористого калия и 0,95%

раствора цитрата натрия; раствор Хенкса, разбавленный дистиллированной водой в объемном соотношении 1 к 4. Пробирки с гипотоническим раствором на 15 мин помещают в термостат при t=37оС, затем их снова центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, удаляют гипотонический раствор, оставляя 0,5 мл супернатанта. Общее время гипотонической обработки должно быть примерно 20-25 мин. Точная продолжительность гипотонической обработки подбирается опытным путем.

После гипотонии к клеточному осадку добавляют свежеприготовленный холодный фиксатор (смесь метилового спирта с ледяной уксусной кислотой в объемном соотношении 3 к 1). Фиксатор добавляют медленно, равномерной струйкой, постоянно перемешивая при помощи вихревого смесителя или пастеровской пипетки для предотвращения образования комков или агрегатов клеток. Через несколько минут (за это время происходит полное разрушение эритроцитов) клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин, отбирают супернатант и добавляют к осадку 5 - 7 мл свежего фиксатора. Эту процедуру повторяют 3 - 4 раза, при этом полная продолжительность фиксации клеток должна составлять не менее 30 - 40

мин. Замену фиксатора прекращают, когда клеточный осадок приобретает белый цвет.

8

При последней промывке удаляют супернатант, оставляя примерно 0,25 – 0,5 мл клеточной суспензии.

Приготовление препаратов хромосом

Одним из условий для получения качественных препаратов хромосом является подготовка предметных стекол. Поверхность стекла должна быть идеально чистой!

Клетки тщательно ресуспендируют в оставшемся фиксаторе с помощью пастеровской пипетки, наносят 3 капли клеточной суспензии с высоты около 10 см на предметное стекло и высушивают его на термоплате при t = 45 – 48оС. Качество препарата оценивают под микроскопом. Хороший препарат должен содержать при малом увеличении ( 200) в

поле зрения не менее 1 - 2 метафазных пластин с расправленными хромосомами без взаимных наложений. При необходимости, если клеток очень много, можно разбавить суспензию фиксатором или наоборот, если их мало, можно осадить клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и затем отобрать некоторое количество супернатанта.

Препараты метафазных хромосом, предназначенные для анализа нестабильных хромосомных аберраций, перед окрашиванием выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 3-5 дней. Препараты метафазных хромосом, которые предназначены для анализа стабильных хромосомных аберраций, рекомендуется использовать для окрашивания в течение первых двух недель после приготовления,

оптимальным сроком хранения считается неделя. Для более длительного хранения препараты метафазных хромосом помещают в герметично запаянные полиэтиленовые пакеты, заполненные газообразным азотом, и хранят в холодильнике при –20оС.

Возможно также хранение клеток в виде фиксированной клеточной суспензии при –20оС.

Анализ нестабильных хромосомных аберраций

Окрашивание методом «флуоресценция плюс краситель Гимза» (FPG метод)

1.Поместить стекла в ванночку с раствором красителя Hoechst 33258 в PBS (конечная концентрация 0,25 мкг/мл) и выдерживать при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин.

2.Поместить ванночку со стеклами на термоплату (t = 60оС) под ультрафиолетовую лампу (265 нм) на 20 мин.

3.Вынуть стекла из раствора красителя, промыть проточной дистиллированной водой.

9

4.Опустить стекла на 5 мин в 5% раствор красителя Гимза в фосфатном буфере (pH

6,8).

5.Промыть стекла в дистиллированной воде и высушить на воздухе.

Препараты просматривают в световом микроскопе при малом увеличении (160

или 200) и выбирают для анализа хорошо окрашенные метафазные пластинки, без наложений хромосом. Затем при увеличении 1000 под масляной иммерсией анализируют только метафазы I митоза, хромосомы которых равномерно окрашены (метафазы II митоза имеют «арлекинную» окраску) и имеют в сумме 46 центромер. Учитывают все типы хромосомных аберраций и заносят их в специальный протокол. При биодозиметрических исследованиях особое внимание уделяют дицентрическим и кольцевым хромосомам,

которые являются маркерами радиационного воздействия.

Анализ стабильных хромосомных аберраций

Для обнаружения транслокаций применяют метод окрашивания, основанный на гибридизации in situ с использованием ДНК проб, специфичных к отдельным хромосомам человека, т. н. FISH метод. Метод FISH основан на способности хромосомной ДНК (ДНК-

мишень) связываться в определенных условиях с фрагментами меченной ДНК (ДНК-

зонд), включающими нуклеотидные последовательности, комплементарные ДНК-мишени.

Ниже описана модифицированная методика гибридизации in situ Пинкеля (Pinkel et al.,1986) с использованием в качестве зондов биотинилированных ДНК_проб,

специфичных к отдельным хромосомам человека, а также панцентромерных ДНК-проб,

меченных дигоксигенином.

Можно использовать готовые наборы для анализа транслокаций фирмы

MetaSystems (http://www.metasystems.de). При работе следует руководствоваться инструкцией, прилагаемой к набору.

Предварительная обработка препаратов метафазных хромосом

Хорошее качество препаратов метафазных хромосом является залогом успешной гибридизации in situ. Важно, чтобы хромосомы на стекле располагались относительно свободно, без взаимных наложений, чтобы количество окружающей их цитоплазмы было минимальным. При большой плотности клеточного материала на стекле реакция гибридизации может быть неэффективной и /или может наблюдаться интенсивный фон вследствие неспецифического связывания ДНК-зонда. Существуют разные способы предварительной обработки препаратов, позволяющие избавиться от нежелательных

10