5 курс-20251107T185252Z-1-001 / Война / Тема 37 / Биологическая индикация радиационного воздействия на организм человека с использованием цитогенетических методов

эффектов. Ниже приведены описания процедур, с помощью которых можно улучшить качество метафазных препаратов.

Обработка пепсином

Предварительная обработка препаратов пепсином позволяет в некоторых случаях избавиться от нежелательного фона. Данная процедура не является обязательной.

Поместить сосуд Коплина со 100 мл дистиллированной воды в водяную баню при t=37оС. За 15 мин до работы со стеклом в воду добавить 100 мкл 10 N HCl, за 10 мин до обработки пепсином добавить 50 мкл 10% пепсина.

1.Поместить стекло на 2 мин в PBS при комнатной температуре.

2.Поместить стекло в 10% раствор пепсина на 10 мин, t= 37оС.

3.Перенести стекло в сосуд Коплина с PBS на 2 мин при комнатной температуре.

4.Промыть стекло в течение 2 мин в растворе PBS/MgCl2 при комнатной температуре на шейкере.

Обработка параформальдегидом

Обработка параформальдегидом позволяет лучше сохранить структуру хромосом в процессе их окрашивания.Эта процедура также не является обязательной.

1. Погрузить стекло на 1 мин при комнатной температуре в 0,25% раствор параформальдегида.

2.Промыть стекло в течение 2 мин в PBS при комнатной температуре.

Использовать шейкер.

3.Провести стекло через серию спиртов - 70%, 90% и 100% растворы по 2 мин при комнатной температуре.

4.Просушить стекла на воздухе или струей газообразного азота.

Денатурация и гибридизация.

Необходимо заранее приготовить 70% раствор формамид/2*SSC в сосуде Коплина и нагреть его до 72оС на водяной бане.

Обработанное с помощью параформальдегида стекло помещают в 70% раствор формамида на 4 мин при t=72оС. Для стекол, не прошедших обработку параформальдегидом, время денатурации сокращается до 2 мин.

Из 70% раствора формамида стекла перенести в охлажденный до t=-20оС 70%

этанол на 2 мин, далее инкубировать по 2 мин в 90% и 100% этаноле при комнатной температуре. Просушить стекла на воздухе или струей газообразного азота.

11

Поместить стекла на термоплату, t=37оС, нанести гибридизационную смесь,

покрыть покровным стеклом так, чтобы под ним не было пузырей воздуха и заклеить края покровного стекла резиновым клеем. Дождаться, пока клей высохнет, положить стекла в предварительно прогретую влажную камеру и поместить ее в термостат t=37оС. Для успешной гибридизации достаточно 12 – 18 часов, в случае необходимости можно продлить срок гибридизации до 3 суток.

Состав и приготовление гибридизационной смеси

При приготовлении гибридизационной смеси необходимо работать только в перчатках, желательно проавтоклавировать используемую одноразовую пластиковую посуду и бидистиллированную воду при 1 атм 120 мин.

Гибридизационную смесь с хромосомными пробами для одного стекла готовят в одной микропробирке (конечный объем гибридизационной смеси для 3-х хромосом – 30

мкл). Гибридизационную смесь с панцентромерной пробой готовят в отдельной микропробирке. Перед нанесением на стекло содержимое микропробирок с хромосомными пробами и панцентромерной пробой объединяют. Когда качество проб неизвестно и требуется определить наиболее оптимальные для конкретных проб концентрации, используется стандартный состав проб (Таблица 1). В случае недостаточно хорошего окрашивания хромосом-мишеней при стандартном составе гибридизационной смеси следует увеличить количества проб тех хромосом, которые плохо окрашиваются,

при этом следует, соответственно, уменьшить количество добавляемой бидистиллированной воды (вплоть до 0 мкл) и/или Cot-1 ДНК (общее конечное количество можно уменьшить до 4 мкл). Количество Master Mix 1.0 и конечный объем гибридизационной смеси менять нельзя!

Таблица 1. Стандартный состав гибридизационной смеси для окрашивания хромосом по методу FISH с использованием ДНК-проб для хромосом 1, 4 и 12 и

панцентромерных проб

*Биотинилированные ДНК пробы, специфичные к хромосомам 1, 4 и 12, получают при помощи ник-трансляции Hind III библиотек pBS-1, pBS-4 и pBS-12. Концентрация ДНК-проб варьирует от 150 до 200 мкг/мл.

**Меченные при помощи digoxigenin-dUTP панцентромерные пробы получают с использованием полимеразной цепной реакции. Концентрация панцентромерных проб варьирует от 100 до 250 мкг/мл.

12

1.Пробирки с хромосомными пробами, Cot-1 ДНК и Master Mix 1.0 достать из холодильника. Разморозить, отцентрифугировать на миницентрифуге в течение нескольких секунд, затем желательно поставить в лед.

2.Компоненты гибридизационной смеси с помощью автоматической микропипетки перенести в микропробирку (каждый компонент своим носиком, носик не использовать вторично даже в случае, когда отбирается один и тот же компонент смеси). Отцентрифугировать на микроцентрифуге в течение 2 - 3 сек, перемешать на шейкере и снова отцентрифугировать.

3.Поместить микропробирку с гибридизационной смесью на 5 мин в водяную баню, t

=72оС.

4.Поместить микропробирку с гибридизационной смесью для быстрого охлаждения на лед на несколько секунд.

5.Микропробирку с гибридизационной смесью и хромосомными пробами поместить в термостат (37оС) на 30 – 60 мин.

6.Денатурация панцентромерной ДНК-пробы также проводится на водяной бане при t

=72оС в течение 5 мин. и затем переносится в лед для быстрого охлаждения на 1 – 5

мин.

7.Содержимое двух микропробирок (с гибридизационной смесью, хромосомными пробами и с панцентромерной пробой) смешать непосредственно перед нанесением гибридизационного коктейля на стекло.

8.Для этого следует отцентрифугировать микропробирку с панцентромерной пробой на микроцентрифуге, перенести ее содержимое в микропробирку с хромосомными пробами и гибридизационной смесью, отцентрифугировать, тщательно перемешать на шейкере и снова отцентрифугировать.

9.Нанести гибридизационный коктейль на препарат, покрыть покровным стеклом

(24*50 мм2), заклеить края покровного стекла резиновым клеем. После засыхания клея препарат поместить в предварительно прогретую влажную камеру, и поместить на ночь в термостат, t = 37оС.

Послегибридизационные отмывки и флуоресцентное окрашивание.

1.Поместить 4 сосуда Коплина с 50% раствором формамида в водяную баню, t=42оC.

Приготовить 300 мл раствора 0,1*SSC, разлить по трем сосудам Коплина, поместить их в водяную баню, t = 60оC.

13

2.Снять пинцетом резиновый клей со стекла. Для того, чтобы смыть покровное стекло,

препарат погрузить на 5 мин в 50% раствор формамида, t=42оC. После удаления покровного стекла препарат должен оставаться в первом растворе формамида 5 мин.

3.Повторить трижды по 5 мин отмывку в 50% растворе формамида, t= 42оC.

4.Трижды по 5 мин отмывать в 0,1*SSC при t=60оC. При проведении окрашивания на вторые митозы на этой стадии удобно провести обработку стекол раствором Hoeсhst (как описано выше).

5.Поместить стекло в PN-буфер на 5 мин при комнатной температуре.

6.Нанести на стекло 100 мкл PNM буфера, покрыть пленкой из плотного полиэтилена и поместить стекло во влажную камеру. Поставить влажную камеру в термостат t=37оC

на 20 мин.

7.После обработки PNM буфером пленку аккуратно снять, препарат поставить вертикально, чтобы стекли остатки PNM буфера, при этом стекло не должно высыхать.

8.На препарат нанести 100 мкл раствора, содержащего равные количества растворов антидигоксигенина и стрептавидина-FITC, покрыть полиэтиленовой пленкой,

поместить стекло во влажную камеру. Окрашивание происходит в темноте в течение

20 мин при комнатной температуре.

9.Промыть дважды по 2 мин в PN-буфере. Использованный буфер выливается.

10.На препарат нанести 100 мкл раствора, содержащего равные количества растворов биотинилированного антистрептавидина и антител IgG Rat-anti-Mouse-AMCA,

покрыть полиэтиленовым покровным стеклом, поместить стекло во влажную камеру,

окрашивание вести в темноте в течение 20 мин при комнатной температуре.

11.Промыть дважды по 2 мин в PN-буфере.

12.На препарат нанести 100 мкл раствора, содержащего равные количества растворов стрептавидина-FITC и антител IgG Mouse-anti-Rat-AMCA, покрыть полиэтиленовым покровным стеклом, поместить стекло во влажную камеру, окрашивание вести в темноте в течение 20 мин при комнатной температуре.

13.Стекло промыть дважды по 2 мин в PN-буфере.

14.Поставить стекло на несколько секунд вертикально для того, чтобы стекли излишки

PN-буфера. Нанести на стекло 22 мкл раствора пропидия иодида в Antifade (PI),

покрыть покровным стеклом (24*50мм2), под микроскопом оценить качество окраски.

Если требуется дополнительное окрашивание, то следует аккуратно смыть покровное стекло в PN-буфере и повторить последовательно стадии 10, 11, 12, 13. Готовые

14

окрашенные препараты хранят при 4оС. Если в процессе микроскопирования и/или хранения выцвел FITC, то можно «освежить» окраску, вновь проделав стадии 10, 11, 12, 13 флуоресцентного окрашивания.

Микроскопический анализ хромосомных аберраций

Готовые препараты анализируют на флуоресцентном микроскопе с помощью набора фильтров, один из которых позволяет наблюдать одновременную флуоресценцию

FITC и PI, второй - АМСА-флуоресценцию, третий фильтр обеспечивает флуоресценцию только PI.

При использовании ДНК-проб для хромосом 1, 4, 12 и флуорохромов FITC, PI и AMCA две пары хромосом (4 и 12) полностью окрашиваются в желтый цвет. Хромосомы

1 окрашены в желтый цвет, исключая небольшую дистальную часть короткого плеча и околоцентромерную область, которые окрашены в красный цвет, так же как и другие хромосомы после окрашивания пропидий иодидом. Центромеры после гибридизации с панцентромерными пробами окрашены в голубой цвет. Если все шесть окрашенных хромосом в клетке являются интактными, клетку признают «нормальной». При наличии в клетке аберрации с участием окрашенной желтой хромосомы, по возможности,

учитывают, какая именно хромосома участвовала в данной аберрации. Конфигурацию,

при которой в клетке имеются две двуцветные хромосомы, взаимно обменявшиеся своими частями, расценивают как «полную» транслокацию Если в клетке одна двуцветная хромосома, а все остальные 45 хромосом красные, транслокацию считают «неполной».

Классификация дицентриков, центрических колец и ацентрических фрагментов принципиально не отличается от принятой в рутинном анализе.

Для анализа частоты транслокаций FISH методом могут быть использованы ДНК-

зонды для самых разных комбинаций хромосом:1, 4 и 12; 1, 4 и 8; 1, 2 и 4 и т.д. Для того,

чтобы сравнивать результаты таких исследований удобно использовать значения геномной частоты транслокаций (FG) и клеточного эквивалента (Neq). Для их определения используют следующие формулы (Lucаs et al., 1992):

FG=FP/2,05*fP*(1-fP),

Neq=2,05*fP*(1-fP)*N,

где FP – наблюдаемая частота транслокаций с участием «окрашенных» хромосом;

N – число проанализированных метафаз, а fP- доля генома, которую составляют

«окрашенные» хромосомы (т.е. относительное содержание ДНК «окрашенных» хромосом). Для хромосом 1, 4 и 12 эта величина составляет 0,19 (Mendelson et al., 1973).

15

Реконструкция дозовой нагрузки по частоте хромосомных аберраций

Для оценки доз в случае острого радиационного воздействия в ранние сроки после облучения проводят анализ нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови классическим цитогенетическим методом. При ретроспективном обследовании, а также в случаях хронического или пролонгированного облучения необходимо проводить анализ стабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови

FISH методом. При реконструкции дозовой нагрузки в первую очередь необходимо оценить уровень значимости различий между спонтанной частотой аберраций и частотой аберраций у облученного пациента (группы пациентов). Если различия являются статистически значимыми, то оценивают дозу облучения с использованием калибровочных кривых «доза-эффект».

Определение статистической значимости наблюдаемых различий частот аберраций

Как уже указывалось выше, статистический анализ цитогенетических данных следует начинать с выяснения вопроса о достоверности повышения частоты аберраций у облученного пациента (группы). Эта стандартная процедура в случае обработки результатов цитогенетического анализа имеет ряд специфических особенностей, что связано с трудностями, возникающими при сравнении частот редких событий. Следует отметить, что многочисленные дискуссии вокруг методов биодозиметрии и радиобиологии малых доз в большинстве случаев связаны со статистической обработкой полученных результатов. При сравнении частот хромосомных перестроек наиболее адекватно использование точного критерия Фишера, поскольку стандартные параметрические критерии (различные модификации t-критерия Стьюдента) являются слишком консервативными в данной ситуации, а для применения непараметрического теста 2 необходимо выявить не менее 5 аберраций как в опыте, так и в контроле. Суть точного критерия Фишера заключается в точном вычислении вероятности Р в

предположении, что облученная и контрольная группы неразличимы по частоте аберраций. При анализе цитогенетических данных число проанализированных клеток Ni

значительно превышает число выявленных аберраций ni (Ni>>ni). В этом случае значение

Р приблизительно равно:

где q=N0/N1, N0 и N1 – число просмотренных клеток в контроле и опыте соответственно,

N=N0+N1, n0 и n1 – число обнаруженных хромосомных перестроек, n=n0+n1, CNn – число

16

сочетаний из N элементов по n. В формуле для вычисления Р член с номером k=n0

превосходит остальные приблизительно на порядок. Его можно использовать для первичных оценок значимости различий на калькуляторе:

Если эта вероятность Р выше 0,05, то различия между контролем и опытом нельзя считать достоверными.

В состав некоторых стандартных статистических пакетов входят программы для вычисления точного критерия Фишера, однако, при их применении следует иметь в виду,

что большинство таких программ (например, Statistiсa, SPSS и многие другие, кроме S-

Plus и Mathematica) не позволяют сравнивать случаи с большим количеством просмотренных клеток.

В таблице 2 и 3 приведены значения вероятности Р, вычисленные согласно точному критерию Фишера для некоторых конкретных количеств просмотренных клеток и выявленных нестабильных и стабильных обменных аберраций соответственно. В

качестве контрольной группы была использована группа жителей Московского региона,

обследованных авторами, частота дицентриков и колец у которых составила 0,02 0,01%

(просмотрено 48124 метафазы), частота транслокаций – 0,15 0,03% (просмотрено 21953

метафазы).

Таблица 2. Значимость отличия P (согласно точному критерию Фишера) частоты дицентриков от контрольного уровня (0,02 0,01% для жителей Московского региона)

н.д. – значение Р больше 0,05, т.е. различия с контролем не достоверны <<0,001 – значение Р как минимум на порядок меньше 0,001

Для корректных заключений о наличии в анамнезе факта радиационного воздействия и о дозовой нагрузке необходимо, прежде всего, проанализировать достаточное количество метафаз. Для детекции облучения по частоте дицентриков и колец, то есть для обнаружения статистически значимых различий с контролем,

17

необходимо выявить не менее, чем 2 нестабильных маркера радиационного воздействия

(см. таблицу 2). Единичные наблюдения дицентриков и колец или транслокаций в сколь

угодно малых количествах просмотренных клеток не могут служить основой ни для

каких-либо заключений о наличии - отсутствии облучения, ни, тем более, для оценок доз.

Таблица 3. Значимость отличия P (согласно точному критерию Фишера) частоты транслокаций, выявленных при помощи ДНК-зондов к 1, 4 и 12 хромосомам, от контрольного уровня (0,15 0,03% для жителей Московского региона)

н.д. – значение Р больше 0,05, т.е. различия с контролем не достоверны <<0,001 – значение Р как минимум на порядок меньше 0,001

Оценка дозовых нагрузок по частоте хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови

Оценка доз облучения по частоте хромосомных аберраций проводится с помощью калибровочных кривых «доза-эффект», которые можно получить в лабораторных условиях при облучении цельной крови in vitro. Необходимо использовать калибровочные кривые, полученные в той же лаборатории, где проводится анализ цитогенетических препаратов. Это обусловлено тем, что на количественную оценку частоты хромосомных нарушений могут оказывать влияние некоторые факторы: условия облучения крови,

особенности приготовления препаратов метафазных хромосом, особенности интерпретации цитогенетических данных, выбор определенной комбинации ДНК-проб для FISH метода.

В настоящей работе представлены калибровочные кривые дозовой зависимости для частоты дицентриков и транслокаций, полученные авторами.

Для построения калибровочной кривой «доза-эффект» кровь от 5 здоровых доноров облучали ( -излучение 60Co с мощностью дозы 0,1 Гр/мин) в диапазоне доз от 0

до 4 Гр. Дозиметрический контроль режима облучения осуществляли с помощью

18

термолюминесцентных дозиметров. В процессе проведения эксперимента строго соблюдали температурный режим (облучение проб крови проводили при t= 30 5оС).

Оценка уровня облучения пациентов по частоте дицентриков в лимфоцитах периферической крови

Втаблице 4 представлены данные по частоте дицентриков, полученные при разных

дозах облучения крови in vitro.

Таблица 4. Частота дицентриков после -облучения цельной крови in vitro

19