Цель постановки, компоненты и сущность полимеразной цепной реакции (пцр).

Цель: диагностика вирусных и бактериальных инфекций (общее). В медицине – диагностика генетических заболеваний, выявление фальсификации продуктов питания, установление родства и др. В ветеринарии – проведение мониторинга ГМО в сырье и пищевой продукции, выявление фальсификации кормов для животных и др.

Компоненты реакции:

1. Матрица – выделенный из исследуемого материала фрагмент ДНК.

2. ДНК-полимераза – фермент, благодаря которому происходит синтез и копирование цепи ДНК.

3. Праймеры – олигонуклеотиды, используемые для репликации. Обрамляют начало и конец копируемого участка.

4. Дезоксинуклеотидтрифосфаты

5. Буферный раствор для поддержания Рн во время постановки ПЦР.

При ПЦР происходит амплификация определенной молекулы ДНК. Амплифицируемый участок – амплификон.

Метод основан на выделении фрагментов ДНК из исследуемого материала и синтезе НК путем амплификации участков генов вирусов или бактерий. Увеличение их количества в миллионы раз происходит при помощи термостабильного фермента ДНК-полимеразы (ТАГ-полимераза).

ДНК из материала выделяют при помощи электрофореза.

Продолжительность реакции определяется числом циклов необходиых для синтеза ДНК. Цикл состоит из 3-х этапов:

1. Денатурация ДНК

2. Присоединение праймеров или отжиг

3. Достраивание или элонгация

Если в исследуемом материале РНК-содержащий вирус, то тогда на его молекуле синтезируют комплементарную цепь ДНК при помощи специфических праймеров (РНК-зависимая ДНК полимераза).

Преимущества ПЦР:

1. Быстрота (1-2 рабочих дня)

2. Высокая чувствительность

3. Специфичность

4. Пригоден любой материал

Недостатки:

1. Выявленная ДНК может принадлежать вакцинному штамму

2. Происходит амплификация не только живого, но и убитого микроорганизма

3. Могут быть различия при использовании разных тест систем.

Болезни

Общая характеристика парвовирусов животных. Характеристика вируса Алеутской болезни норок (плазмоцитоза) (АБН). Методы лабораторной диагностики.

Парвовирусы энтеритов собак, кошек, норок. Характеристика вирусов, методы лабораторной диагностики и средства специфической профилактики болезней.

Семейство: Parvoviridae

Подсемейства:

Parvovirinae – заболевания человека и животных.

Densovirinae – заболевания насекомых.

По способности к размножению в клетках хозяина различают:

Автономные парвовирусы способны самостоятельно инициировать свою репродукцию. Они размножаются в S-фазе клеточного цикла, то есть во время удвоения клеточной ДНК.

Дефектные парвовирусы реплицируются только в присутствии вируса-помощника, которым является любой аденовирус или вирус простого герпеса. 

Общие свойства:

1. Малые размеры (17-28 нм)

2. Однонитчатая ДНК

3. Капсид из 32 капсомеров

4. Отсутствует суперкапсид

5. Высокая устойчивость во внешнй среде

6. Триангуляционное число (Т; ?) = 1

7. Нуждается в быстрорастущих клетках, так как синтез ДНК-полимераз происходит только на протяжении S-фазы клеточного цикла

8. Пантропные, но репродукция в наиболее митотически активных тканях (костный мозг, кишечник, ткани плодов)

Алеутская болезнь норок (родства с другими паровирусами не имеет) – контагиозная медленно развивающаяся инфекционная болезнь, характеризующаяся системной пролиферацией лимфоидных клеток (генерализованным плазмоцитозом), гипергаммаглобулинемией, явлениями геморрагического диатеза, артериитом, гепатитом, прогрессирующим истощением зверей, рассасыванием плодов у самок. Медленное развитие с летальным исходом за 2-24 месяца.

Эпизоотология: Восприимчивы норки всех окрасов, но чаще заболевают нарки с гомозиготным рецессивным геном «аа» (алеутские, сапфировые, голубые).

Клинические признаки: истощение при хорошем аппетите, вялость, угнетение, кровотечения из носа и рта, каловые массы с примесью крови, мертворождение.

Поражаются органы кроветворения

Вирус стимулирует пролиферацию плазматических клеток, которые вырабатывают АТ, вступающие с ним в реакцию. АТ не нейтрализуют вирус, продолжается персистенция вируса и не прекращается формирование иммунных комплексов. Появляются аутоантигены, которые стимулируют пролиферацию плазматических клеток и продукцию аутоантител.

Патанат: Трупы зверей истощены. На деснах, твердом и мягком небе у некоторых норок видны множественные мелкие кровоизлияния и язвы. Развиваются характерные изменения, в костном мозге, селезенке, лимфатических узлах, почках, печени. Наиболее характерны патолого-анатомические изменения в почках.

Диагностика.

Диагноз ставится комплексно с учетом эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений и подтверждается в условиях лаборатории. (Общее для всех болезней)

Патмат: сыворотка крови, головной мозг, лимфоузлы, почки, селезёнка, печень, кишечник.

Диагноз ставят на основе серологических реакций МФА, ИФА и РИЭОФ (реакция иммуноэлектроосмофореза)

Выделение на норках или на перевиваемой линии почки кошек

Биопрепараты отсутствуют.

Парвовирусная инфекция у собак «Олимпийка» (различают СПВ-1 и СПВ-2) – высококонтагиозная болезнь собак, характеризующаяся острым геморрагическим энтеритом, обезвоживанием, лейкопенией и миокардитом.

Эпизоотология: СПВ-2 является наиболее распространенным среди остальных парвовирусов плотоядных, вызывает клинически выраженную патологию. После инфицирования не иммунных собак выделяется с экскрементами в течение года. СПВ-2 протекает в виде поражения отдельных пометов, не характерна сезонность.

СПВ-1 не вызывает на иммунных животные вспышек болезни, а протекает в виде отдельных легких случаев с благоприятным исходом.

АГ-нная структура: Большая часть парвовирусов антигеннородственна, но различается по биологическим свойствам и уровням репродукции и патогенности для тех или иных хозяев. Один и тот же вирус может вызывать заболевание различного течения у разных видов плотоядных животных. Вместе с тем, антигенное родство в данном случае не означает антигенного равенства, и не обеспечивает устойчивости к повторному заражению.

Течение: молнеиностное, острое, подострое, хроническое с истощением.

Патанат: изменения слизистой кишечника, рождение нежизнеспособного молодняка.

Панлейкопения кошек (ПЛК) – высококонтагиозная болезнь кошек, характеризующаяся панлейкопенией, рвотой, лихорадкой, диареей и обезвоживанием.

Эпизоотология: Вирус ПЛК распространен повсеместно среди домашних кошек. Чаще болеют кошки в возрасте 7-12 мес до 2-х лет, а при повторном инфицировании-кошки всех возрастов. Все не привитые инфицируются на первом году жизни. Протекает в виде спорадических случаев.

ПЛК – это системная инфекция, поражается не только эпителий кишечника, но и другие органы.

Энтерит норок - острая контагиозная болезнь, характеризуется угнетением животных и фибринозно-геморрагическим энтеритом.

Эпизоотология: вызывает на не иммунных животных фатальный энтерит, на иммунном фоне склонен к длительной персистенции. Чаще болеют норки с 8 мес. возраста. Энтерит норок обычно протекает в виде опустошительных эпизоотий с уровнем смертности среди заболевших 60-100%.

Диагностика парвовирусных инфекций:

Патматериал: При ПЛК и энтерите норок - кусочки селезёнки, мозга, 12-ти перстной кишечника; При СПВ - фекалии (в первые 1-4 дня), сыворотки крови (лучше парные), сердечные мышцы и тонкий к-к; от больных кровь и содержимое к-ка, выделения.

Обнаружение вируса: РГА, МФА для выявления вирусного антигена в ядрах клеток слиз. киш., ИФА для СПВ

Выделение вируса: на первичной КК почек эмбр. котят. СПВ и ПЛК не даёт ЦПД в КК, поэтому вирусный АГ в КК выявляют с помощью МФА. Вирус энтерита норок ещё перевив. КК эмбрионов норок. Вирус ПЛК не выделяется  на лабораторных животных.

Идетификация и дифференциация: 

РН в КК наиболее надёжный метод; РЗГА;

ИФА - СПВ;

РДП - энтерит норок.

Биопрепараты:

Лечебные: Поливалентные гипериммунные сыворотки против парвовирусных инфекций, против чумы и гепатита; для щенков моноспецифические иммуноглобулины или моновалентные гипериммунные сыворотки против парвовирусного энтерита собак.

Профилактические:

Вакцины для собак из живых аттенуированных штаммов СПВ или гетерологичного вируса ПЛК- ассоциированные с другим Аг - «тетравак»  

Вакцины для норок (в состав входит гертерол. живой Аг ПЛК): - ассоциированная  вакцина против  вируса  энтерита, чумы ботулизма, псевдомоноза; - ассоциированная пр. вируса энтерита, чумы, ботулизма.

Живые культуральные и инакитивированные зарубежные вакцины против ПЛК.