Цель, сущность, постановка и учет результатов иммуноферментного анализа (ифа).

Метод ИФА ос­нован на использовании для диагностики антител меченых ферментами. Для метки применяют такие ферменты как пероксидазу хрена, щелоч­ную фосфатазу и др.

Цель: идентификация вируса; определение титра АТ и динамики их нарастания.

Для идентификации вируса иммуноферментный тест применяют в двух вариантах: гистохимический и твердофазный.

Компоненты: + и – контроли; конъюгат (АТ меченые ферментом); субстрат (вещество, которое при взаимодействии с ферментом образует цветной продукт реакции), стоп-раствор, буфер для разведения конъюгата.

ИФА содержит 3 обязательные стадии: 1. Стадия узнавания исследуемого соединения специфическим антителом; 2. Стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания; 3. Стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

Для выявления вируса с помощью данного метода в вируссодержащем материале наиболее часто используют метод двойных антител или «сэндвич-метод».

Для этого лунки полистироловых микропанелей сенсиби­лизируют гамма-глобулином, выделенным из специфической к иссле­дуемому антигену сыворотки. В лунки вносят по 0,2 мл гамма-глобу­лина в нужной концентрации в буферном растворе. Инкубируют 1 час при 37°С и затем оставляют на ночь при 4°С.

Наутро из лунок сливают раствор гамма-глобулина, промывают лунки пане­ли 3 раза буфером с рН-7.4, затем в лунки вносят по 0,2 мл раствора, содержащий антиген, и инкубируют 2 часа при 37°С.  В контрольные лунки вносят заведомо известный положительный и негативный антигены.

Микропанели за­тем промывают 3 раза буфером. Затем в лунки вносят по 0.2 мл иммуноферментного конъюгата и инкубируют 1-2 часа при 37°С, промывают буфером 3 раза и вносят в лунки по 0.2 мл раствора субстрата, инкубируют в темноте при комнатной температуре 5-30 минут. Реакцию останавливают добавлением стоп-раствора.

Учиты­вают реакцию визуально по разности в окраске опытных и контрольных образцов.  Также учет реакции ИФА можно проводить с помощью спектрофотометра.

Люминесцентная микроскопия в вирусологии. Метод флуорохромирования (мф) и методы флуоресцирующих антител (мфа).

В люминесцентной микроскопии используется явление фотолюминесценции, т. е. способность объекта светиться (издавать свечение) в момент облучения его ультрафиолетовыми лучами. Источниками та­ких лучей в люминесцентном микроскопе являются ртутно-кварцевые лампы. 

Метод флуорохромирования. По своей технике этот метод принципиально почти ничем не отличается от методов обычной ок­раски мазков, применяемых при световой обычной микроскопии. Для этих целей используют также анилиновые красители, но краски берут такие, которые обладают явлением фотолюминесценции, т.е. светятся в момент облучения их ультрафиолетовыми лучами. Такие краски на­зываются флуорохромами.

Методы флуоресцирующих антител (МФА), иммунофлуоресценция (ИФ). МФА (ИФ) основаны на принципе специфическо­го взаимодействия антигена со специфическими антителами, но ис­пользуют здесь антитела меченые, т.е. предварительно окрашенные флуорохромом, и поэтому такие антитела под ультрафиолетовыми лучами светятся (флуоресцирующие антитела). Наиболее часто для окрашивания антител применяют ФИТЦ, эта краска дает антителам салатно-зеленое свечение. Поэтому, если в мазке есть антиген специ­фический данным антителам, то антитела, оседая и связываясь с дан­ным антигеном, будут обеспечивать образовавшемуся комплексу свечение салатно-зеленым цветом.

МФА находят широкое применение при диагностике многих ви­русных болезней - бешенство, грипп, болезнь Аусеки, вирусный гепа­тит плотоядных и чума, оспа, ИРТ, ИЛТ и многие др.