Методы заражения клеточных культур (кк). Определение результативности заражения клеточных культур вирусами.

Для заражения вируссодержащим материалом выбирают такие про­бирки или матрацы с культурой тканей, в которых сформировался сплошной клеточный монослой. Наиболее широко используют в ди­агностических целях первично-трипсинизированные культуры.

Есть 2 варианта заражения:

1. Сначала удаляют ростовую среду, после чего одновременно вносят 0,1 мл вируса и 0,9 мл поддерживающей среды.

2. После удаления ростовой среды вносят 0,1 мл вируса и оставляют на контакт в 1-2 ч в термостате. После чего излишки вируса удаляют и уже тогда вносят поддерживающую среду.

Второй вариант считается лучше, так как в первом у нас избыток вируса.

За зараженными культурами ежедневно наблюдают просмотром под микроскопом и отмечают характер дегенеративных изменений в клетках. Под действием вируса пораженные клетки уже через 24 часа или позже начинают деформироваться, подвергаются деструкции, мо­жет появиться зернистость, округление клеток, вакуоли, в некоторых случаях происходит слияние клеток с образованием большой много­ядерной клетки или образуются симпласты и синцитии. Пораженные клетки могут группироваться в гроздья и затем разрушаются, отпадают от стенки и появляются пустоты в монослое клеток. Все эти измене­ния хорошо видны под микроскопом.

Серологическая диагностика вирусных болезней. Сущность, виды и назначение серологических реакций.

В серологических реакция принимает участие минимум 2 компонента: АГ (известный диагностический вирус или неизвестный из патматериала) и сыворотка (известная диагностическая или неизвестная исследуемая). В сыворотке могут содержаться АТ к тому или иному вирусу.

Антигены у различных групп вирусов строго специфичны и могут реагировать только с соответствующими антителами. У вирусов, вхо­дящих в одну группу, некоторые антигены могут быть общими для всей группы (группоспецифические), другие антигены являются специфич­ными только для одного какого-либо штамма данной группы (штаммоспецифические).

В зависимости от применяемых серологических реакций антиге­ны, участвующие в них, называются, так же, как и антитела, по-разному: в РСК – комплементсвязывающий антиген, в РН – антиген, вызываю­щий образование вируснейтрализующих антител, в РДП – преципи­тирующий антиген (преципитиноген), в РЗГА и РГА – гемагглютинирующий антиген (гемагглютинин) и т.д.

Варианты взаимодействия:

• Лизис (лизирование АГ)

• Агглютинация (склеивание АГ)

• Преципитация (2 изначально прозрачных компонента при взаимодействии изменяют свою оптическую плотность и образуют продукт взаимодействия серо-белого цвета).

Цель, сущность, техника постановки реакции диффузионной преципитации в агаровом геле (рдп) (рид). Учет реакции и контроли.

Сущность реакции заключается в том, что специфические антиген и антитело, помещенные на определенном расстоянии друг от друга в агаровом геле, диффундируют в среду и в местах их встречи образуют полосы преципитации. При несоответствии антигена антителам (в отрицательных случаях) полосы преципитации не образуются.

Цель: идентифицировать и титровать выделенный вирус; определить наличие специфических АТ в сыворотке.

Компоненты: АГ, АТ

Для постановки реакции заранее готовят 1%-ный агаровый гель из высоко очищенных сортов агара (агар Дифко). Ставят реакцию в чашках Петри. В чашку вносят расплав­ленный в кипящей бане 1%-ный агаровый гель в количестве 25-30 мл с таким расчетом, чтобы слой был 3-4 мм. После застывания агара в нем делают лунки с помощью пробойника. При больших объемах исследований лунки часто располагают в форме шестиугольника (одна лунка в цен­тре и шесть по периферии, где чаще всего известный компонент в центре, а неизвестные по периферии). После заполнения лунок чашку ставят в термостат при 37°С и, чтобы не было высыхания агара, в чашку кла­дут кусочек ваты, смоченной водой.

Учет реакции проводят через 24-48 и 72 часа. В положи­тельных случаях между лунками со специфическими компонентами появляется за счет образования преципитата серо-белая полоса пре­ципитации, хорошо видимая на темном фоне. 

Параллельно ставят контроли с заведомо известными + и – сыворотками и стандартным АГ.