3. Питательные среды. Требования, предъявляемые к питательным средам, их состав и классификация.

4. Способы создания анаэробных условий. Аппаратура для создания анаэробных условий.

Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.

1.Физические методы - откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N2- 85%, CO2- 10%, H2- 5%).

2.Химические методы - применяют химические поглотители кислорода.

3.Биологические методы - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).

4.Смешанные методы - используют несколько разных подходов.

Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов - очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание бескислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно-восстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов - предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий - анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система “Газпак” со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

Для создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов используют различные методы:

• Физические методы. Удаление кислорода из жидкой или плотной питательной среды путём кипячения или прогревания пробирок на кипящей водяной бане в течение 15–20 минут и быстрым охлаждением под струёй холодной воды. После засева поверхность среды, разлитой высоким слоем, заливают слоем стерильной смеси вазелинового масла и парафина. Также можно использовать специальные пробирки, из которых после засева откачивают воздух с помощью вакуум-насоса.

• Химические методы. Связывание свободного кислорода, содержащегося в среде или в сосуде для выращивания анаэробов, с помощью химических веществ. Некоторые из них помещают вне среды, другие вводят в качестве восстановителей непосредственно в питательные среды. Химическими поглотителями кислорода являются растворы пирогаллола с Na2СO3, щелочной раствор гидросульфита натрия (дитионита), металлическое железо и другие реактивы.

• Биологические методы. Некоторые анаэробные микроорганизмы можно выращивать при доступе кислорода совместно с аэробами. В герметически закрытый сосуд помещают 10–15 пробирок с посевами аэробных культур и одну пробирку с анаэробами. Аэробные микроорганизмы энергично поглощают кислород, выделяют СО2 и создают условия для роста анаэробов.

• Комбинированные методы. Представляют собой сочетание различных способов удаления кислорода.

Некоторые виды аппаратуры для создания анаэробных условий:

• Анаэробные камеры. Прозрачная герметичная станция, может быть как перчаточной, так и безперчаточной. Необходимые условия создаются в ней посредством возникновения вакуума и добавления двухкомпонентного (N2 + H2) или трёхкомпонентного (N2+CO2+H2) анаэробного газа. Камера оснащена специальными шлюзами, термостатом, контролирующим влажность, приборами для регуляции концентрации кислорода и его вывода из рабочей зоны. 6

• Микроанаэростат. Бочкообразная, герметично закрываемая металлическая или пластмассовая ёмкость объёмом от 2 до 7 литров. Создание необходимых условий в агрегате происходит двумя способами: вакуумозамещение (создаётся вакуум и запускается анаэробный газ) и химическое связывание кислорода (используется газогенерирующая система). 6

• Анаэробный пакет. Это прозрачный пластиковый пакет с герметичным закрыванием и объёмом до двух чашек Петри. Создание анаэробных условий создаётся путём взаимодействия реакционной безводной системы с кислородом. Пакет оснащён полоской-индикатором. 6

• Система Anoxomat. Прибор работает при помощи встроенного компьютера и подключается к 1 или 2 баллонам с газовой смесью. Anoxomat быстро удаляет из ёмкости воздух, содержащий кислород, и замещает его точным объёмом анаэробной газовой смеси