3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

Д. Снижение порога фибрилляции.

Е.Появление аритмий, которые стало труднее или вообще невозможно купировать. II. Появление новых аритмий:

А. наджелудочковая тахикардия.

Б. Наджелудочковая экстрасистолия. В. Желудочковая экстрасистолия.

Г. Полиморфные желудочковые тахикардии. Д. Аритмии типа «пируэт».

Е. Развитие фибрилляции желудочков. III. Развитие брадиаритмий:

А. Появление синусовой брадикардии и остановки синусового ритма или развитие синоатриальной блокады.

Б. Развитие атриовентрикулярной блокады.

4.2.2.1. Исследование влияния изучаемых соединений

на продолжительность корригированного интервала QT (QTс) Исследование проводится на бодрствующих морских свинках массой 300–400 г. Жи-

вотных фиксируют на операционном столе в положении на животе и регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение, длительность регистрации 30 с). Затем внутрибрюшинно вводят изучаемое соединение и через 30, 60, 90 и 120 мин повторно регистрируют ЭКГ. Анализируют ЭКГ и определяют продолжительность интервалов RR, PQ и QT. Продолжительность интервала RR отражает частоту сердечных сокращений, продолжительность интервала PQ – скорость атриовентрикулярного проведения, а продолжительность интервала QT – продолжительность потенциала действия желудочков. Так как продолжительность интервала QT зависит от частоты сердечных сокращений, определяют независимый от ЧСС корригированный интервал QT, который рассчитывается по следующей формуле:

QTc= QT (мс) / RR (с).

Поскольку многие антиаритмические средства обладают способностью «кумулятивно» удлинять интервал QT, в следующей серии экспериментов оценивают влияние изучаемого соединения на продолжительность интервала QT после его 7-дневного внутрибрюшинного введения. В этом случае ЭКГ регистрируют до и после окончания 7-дневного введения изучаемого соединения.

В тех случаях, когда изучаемое соединение в остром или хроническом эксперименте удлиняет корригированный интервал QT более чем на 20–25%, его исключают из дальнейшего исследования.

4.2.2.2. Исследование аритмогенных влияний изучаемых соединений Исследования проводятся на наркотизированных (уретан 1,0–1,3 г/кг, внутрибрю-

шинно) нелинейных крысах-самцах массой 200–250 г. Животных фиксируют на операционном столе в положении лежа на спине и регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение, продолжительность записи 30 с). Затем подбирают минимальную дозу цезия хлорида, которая вызывает злокачественные нарушения ритма сердца. В следующей серии экспериментов внутривенно вводят изучаемое соединение и через 5–10 мин подобранную дозу цезия хлорида. В том случае, если на фоне изучаемого соединения количество злокачественных нарушений ритма сердца увеличивается и/или пороговая доза цезия хлорида сдвигается влево (уменьшается), то это свидетельствует о наличии у изучаемого соединения аритмогенного действия. Если изучаемое соединение увеличивает количество эпизодов тахикардии типа «пируэт», его исключают из дальнейшего исследования.

411

4.2.2.3. Исследование триггерной активности изучаемых соединений Эксперименты проводятся на наркотизированных (α-хлоралоза 90–120 мг/кг вну-

тривенно) кроликах-самцах массой 2,5–3 кг. Животных фиксируют на операционном столе в положении на спине, проводят трахеотомию и переводят на искусственное дыхание кислородно-воздушной смесью в соотношении 1 : 1 (возможно дыхание комнатным воздухом). Катетеризируют бедренную артерию для измерения артериального давления и бедренную вену для введения изучаемых соединений. Затем регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение, длительность регистрации 60 с), после чего в течение 15 мин проводят инфузию a-адреностимулятора метоксамина со скоростью 15 мг/кг/мин. По окончании инфузии метоксамина начинают инфузию изучаемого соединения, которую продолжают в течение часа. Оценивают количество эпизодов желудочковой тахикардии и тахикардии типа «пируэт» и сравнивают их количество с аналогичными показателями, полученными для референтных препаратов. В том случае, если количество злокачественных нарушений ритма у изучаемого соединения выше, чем у референтного препарата, его исключают из дальнейшего исследования.

По завершении II этапа исследования, в случае выявления потенциального антиаритмического соединения, превосходящего по своей активности референтные антиаритмические ЛС, определяют возможные показания, дозы и схемы его клинического применения, спектр побочных эффектов и переходят к следующим этапам исследования.

4.2.2.4. Исследование влияния изучаемых соединений на гипополяризацию кардиомиоцитов, вызванную калия хлоридом [9]

Исследования проводят на нелинейных крысах обоего пола массой 160–200 г. Животных фиксируют под этаминал-натриевым наркозом (35 мг/кг внутрибрюшинно) и регистрируют ЭКГ во II стандартном отведении. Животных разделяют на 4 группы. В 1-ю (контрольная; n = 5) входят крысы, которым внутривенно вводят физиологический раствор по 0,2 мл в течение 2 с. ЭКГ регистрируют в момент введения раствора и последующие 30 с. Во 2-ю (n = 10) — животные, получающие внутривенно 1,5% раствор KCl в ранее установленной минимальной аритмогенной дозе (в среднем 20 мг/кг), в течение 2 с (ЭКГ регистрируют непрерывно до нормализации синусового ритма). Минимальную аритмогенную дозу KCl определяют путем постепенного увеличения объема 1,5% раствора KCl, вводимого в бедренную вену в течение 2 с. Таким образом, эмпирически подбирают дозу, при которой нарушения ритма и проводимости регистрируются в течение 3–10 с. Интервал между повторными внутривенными инъекциями KCl должен быть не менее 15 мин.

Введение физиологического раствора животным 1-й группы не изменяет ЭКГ. У крыс 2-й группы после введенияKCl на ЭКГ регистрируются атриовентрикулярные и внутрижелудочковые блокады разных степеней, а также экстрасистолическая аритмия сердца. Продолжительность нарушений ритма обычно не превышает 10 с.

Крысам 3-й группы (n = 10) внутривенно вводят изучаемое вещество в оптимальных антиаритмических концентрациях и дозах, а через 5 мин — 1,5% раствор KCl в дозе 20 мг/кг. ЭКГ регистрируют до нормализации синусового ритма.

Крысам 4-й группы (n = 10) за 5 мин до введения KCl проводят инфузию референтного препарата — новокаинамида (1% раствор 20 мг/кг) или амиодарона (0,5 раствор 10 мг/кг). Новокаинамид через 3–4 мин после введения KCl вызывет на ЭКГ внутрижелудочковые и атриовентрикулярные блокады, кардиоплегию (полную атриовентрикулярную блокаду), которая продолжается 1–3 мин [9]. Затем появляются редкие желудочковые комплексы идиовентрикулярного ритма. В течение 2,0–2,5 мин частота сердечного ритма у большинства крыс (6 из 10) повышается, и идиовентрикулярный ритм трансформируется в регулярную синусовую брадикардию. У части животных (3) идиовентрикулярный ритм прогрессивно замедляется, дыхание прекращается, и животные погибают. При использовании амиодарона наблюдаются такие же изменения ЭКГ. Летальность отмечена в единичных случаях (у 1 крысы).

412

При анализе изменений ЭКГ авторы метода выделяют 4 степени гипополяризации плазматических мембран кардиомиоцитов: к I степени отнесены случаи, при которых после внутривенного введения минимальной дозы KCl в течение 2 с у животных регистрируется замедление атриовентрикулярной и внутрижелудочковой проводимости без аритмий сердца, ко II – те же изменения и появление эктопических нарушений ритма сердца, к III – кратковременную кардиоплегию, при которой развивается полная атриовентрикулярная блокада при сохранении зубцов Р и отсутствии желудочковых комплексов (после возобновления комплекса QRS у части животных появляется эктопическая пейсмекерная активность, что на ЭКГ проявляется единичными или групповыми экстрасистолами; продолжительность кардиоплегии у разных крыс может колебаться в пределах от 1 с до 2–3 мин), к IV - остановку сердца и гибель животных.

Статистическую обработку количественных показателей проводят по методу вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

Полученные результаты заносят в таблицу. В качестве примера см. таблицу 2, отражающую влияние KCl, новокаинамида и амиодарона на К+-индуцируемые аритмии сердца у крыс.

Прижизненная регистрация гипополяризационных аритмий сердца без вскрытия грудной клетки позволяет исследовать аритмогенные эффекты антиаритмических веществ, в том числе не входящих в классификацию Vaughan Williams, например гликозидных кардиотоников, которые в силу особенностей механизма своего антиаритмического действия не могут быть отнесены к какому-либо из 4 классов антиаритмиков, а также изучать патогенез внезапной смерти при использовании блокаторов Na+-каналов.

Представленный метод определения гипополяризации мембран, степени ее выраженности и регистрации гипополяризационных аритмий сердца отличается предельной простотой и легко применим в лабораториях экспериментальной фармакологии и кардиологии. Однако для получения воспроизводимых результатов исследования необходимы точная дозировка раствора КCl и расчет скорости его внутривенного введения (по секундомеру).

Примечание. *р < 0,05, **р < 0,01 по сравнению со 2-й группой.

5. Исследование фармакокинетики, биодоступности изучаемых антиаритмических лекарственных средств

и сопоставление их фармакодинамики и фармакокинетики

Для сопоставления фармакодинамики и фармакокинетики антиаритмических препаратов обычно используют модель желудочковой аритмии на собаках, полученную с

413

помощью метода Harris. У собак берут пробы крови до введения препарата и после его введения. Промежутки времени забора крови определяют в каждом отдельном случае в соответствии с длительностью действия препарата.

В большинстве исследований для изучения фармакокинетики используют метод ВЭЖХ. Важную роль в фармакокинетике препарата играют возможные активные метаболиты, которые могут брать на себя долю антиаритмического действия. Расчет показателей фармакокинетики и биодоступности не отличается от расчета показателей при изучении препаратов других типов действия. Очень важным для любого препарата является его биодоступность.

Заключение

Рекомендованный комплекс методов позволит выявить соединения, которые по спектру и характеру своего действия могут быть предложены для КИ в качестве антиаритмических средств.

Вместе с тем не следует забывать, что в ходе клинического изучения нового препарата может возникнуть необходимость проведения дополнительных экспериментальных исследований, направленных на более детальное изучение механизмов действия, имеющее большое значение для оптимизации клинического применения каждого из предложенных средств.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литературa

1.Адрианов О.С., Меринг Т.А. Атлас мозга собаки. — М.: Медгиз, 1959. — 236 с.

2.Буряк М.А. Влияние ингибиторов моноаминоксидазы на аритмии сердца и нарушения коронарного кровообращения, вызванные раздражением структур гипоталамуса и понтомедуллярного отдела ствола мозга // В кн.: 27 науч. сессия института по вопросам экспериментальной и клинической кардиологии. — Курск, 1968. — С. 26–30.

3.Буряк М.А. Влияние холинолитиков и анаприлина на аритмии сердца и нарушения коронарного кровообращения, вызванные стимуляцией гипоталамуса у собак с перенесенным инфарктом миокарда // В кн.: Фармакологическая коррекция кровоснабжения, метаболизма и жизнеспособности ишемизированного миокарда. — Воронеж, 1977. — С. 44–48.

4.Вислобоков А.И. Мембранотропное действие фармакологических средств / А.И. Вислобоков, Ю.Д. Игнатов, П.А. Галенко-Ярошевский, П.Д. Шабанов — СПб.; Краснодар: ПросвещениеЮг, 2010. — 528 с.

5.Галенко-Ярошевский П.А. Методы поиска и доклинического исследования специфической активности потенциальных сердечно-сосудистых средств / П.А. Галенко-Ярошевский, В.В. Гацура. — Краснодар: Просвещение-Юг, 2005. — 249 с.

6.Каверина Н. В. Методические указания по изучению антиаритмической активности фармакологических веществ / Н.В. Каверина, Ю.С. Бердяев, Е.П. Кищук, О.Е. Пасхина: руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. — М., 2005. — С. 421–437.

7.Камкин А. Г. Физиология и молекулярная биология мембран клеток / А.Г. Камкин, И.С. Киселева // М.: Академия. — 2008, 586 с.

8.Камкин А. Г. Физиология: руководство к экспериментальным работам / А.Г. Камкин, И.С. Киселева. — М.: Гэотар-Мед, 2011. — 384 с.

9.Мороз В.В. Моделирование гипополяризационных аритмий сердца и определение степени гипополяризации мембран кардиомиоцитов у экспериментальных животных / В.В. Мороз, Т.Н. Липницкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2006. — Т. 142. — № 12. — С. 704–706.

10.Резник А.В. Ионные каналы и токи в кардиомиоцитах / А.В. Резник, В.В. Федоров, Л.В. Розенштраух // Кардиология. — 2006. — № 2. — С. 4–18.

414

11.Розенштраух Л.В. Сравнение интенсивности действия этмозина и его диэтилового аналога на эктопические очаги возбуждения в поздней стадии экспериментального инфаркта миокарда / Розенштраух Л.В., Анюховский В.П., Белошапко Г.Г. и др. // Кардиология. — 1981. — Т. 21. — № 10. — С. 75–79.

12.Сутягин П. В. Основные закономерности взаиморасположения разных типов клеток-водителей ритма в синусно-предсердном узле сердца крыс / П.В. Сутягин, А.Г. Камкин, О.Ю. Гурина // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 2009. — Т. 148. — № 9. — С. 343–346.

13.Фифков Е., Маршал Дж. Стереотаксические атласы мозга колки, кролика и крысы // В кн.: Электрофизиологические методы исследования. — М., 1962. — С. 384–426.

14.Шейх-Заде Ю. Р. Фибрилляция предсердий: новое объяснение старого явления / Ю.Р. ШейхЗаде, П.А. Галенко-Ярошевский, И.Л. Чередник // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 2002. — Т. 134. — № 7. — С. 4–8.

15.Alles G.F. Comparative actions of certain compounds like alpha-fagorine / G.F. Alles, C.H. Ellis // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1948. – Vol. 94. – P. 416–425.

16.Chidlow G, Melena J, Osborne №.N. Betaxolol, a beta(1)-adrenoceptor antagonist, reduces Na+ influx into cortical synaptosomes by direct interaction with Na+ channels: comparison with other beta-adrenoceptor antagonists. // Br J Pharmacol., 2000 Jun; 130 (4): 759–66.

17.Ciranna L. Serotonin as a modulator of glutamateand GABA-mediated neurotransmission: implications in physiological functions and in pathology. // Curr Neuropharmacol., 2006 Apr; 4 (2): 101–14.

18.Dunkley P.R., Jarvie P.E., Robinson P.J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. // Nat Protoc. 2008; 3 (11): 1718–28.

19.Dunlop J. Ion channel screening / J. Dunlop [et al.] // Comb. Chem. High Throughput Screen. — 2008. — V. 11. - № 7. — P. 514–522.

20.Engblom A.C., Akerman K.E. Determination of the intracellular free chloride concentration in rat brain synaptoneurosomes using a chloride-sensitive fluorescent indicator. // Biochim Biophys Acta, 1993 Dec 12; 1153 (2): 262–6.

21.Galván E, Sitges M. Characterization of the participation of sodium channels on the rise in Na+ induced by 4-aminopyridine (4-AP) in synaptosomes. // Neurochem Res., 2004 Feb; 29 (2): 347–55.

22.Gerard R.W. Electrical activity of the cat's brain / R.W.Gerard [et al.] // Arch. Neurol. Psychiat. — 1936. — Vol. 36. — № 4. — P. 675–738.

23.Gri n H.D., Hawthorne J.N. Calcium-activated hydrolysis of phosphatidyl-myo-inositol 4-phosphate and phosphatidyl-myo-inositol 4,5-bispho-sphate in guinea-pig synaptosomes. // Biochem J., 1978 Nov 15; 176 (2): 541–52.

24.Harris A.S Delayed development of ventricular ectopic rhythms following experimental coronary occlusion // Circulation. — 1950. — Vol. 1, № 6. — P. 1318.

25.Harrison D. C. Antiarrhythmic drug classification: new science and practical applications // Am. J. Cardiology, 1985. — V.50. — P. 185–187.

26.Jasper H. A stereotaxic atlas of the diencephalon of the cat / H. Jasper, C. Ajmole-Marsan — Ottawa,– 1954. — 324 р.

27.Johnson B. E. Pressure-polishing pipettes for improves patch-clamp recording / B.E. Johnson, A.L. Brown, M.B. Goodman // J. Vis. Exp., 2008. — V. 20. — P. 964.

28.Kalia L.V., Kalia S.K., Salter M.W. NMDA receptors in clinical neurology: excitatory times ahead. // Lancet Neurol., 2008 Aug; 7(8): 742–55.

29.Kau mann A. J. Prevention of ventricular fibrillation induced by coronary artery ligation / A.J. Kau mann, P. Aramendia // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1968. — V. 164. — № 2. — P. 326–332.

30.Lodge D. The history of the pharmacology and cloning of ionotropic glutamate receptors and the development of idiosyncratic nomenclature // Neuropharmacology, 2009 Jan; 56(1): 6–21.

31.Minta A., Kao J.P.Y., Tsien R.Y. // J. Biol. Chem., 1989. — Vol. 264. — P. 8171–8178.

32.Monassier L. s2-Receptor ligand-mediated inhibition of inwardly rectifying K+ channels in the heart / L. Monassier [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Therap. — 2007. — V. 322. — № 1. — P. 341—350.

33.Moult P.R.. Neuronal glutamate and GABAA receptor function in health and disease // Biochem. Soc. Trans., 2009 Dec; 37(Pt 6): 1317–22.

34.Ohno Y. New insight into the therapeutic role of 5-HT1A receptors in central nervous system disorders // Cent. Nerv. Syst. Agents. Med. Chem., 2010 Jun 1; 10 (2): 148–57.

415

ГЛАВА 24

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ПРОТИВОИШЕМИЧЕСКОГО

(АНТИАНГИНАЛЬНОГО) ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: д. м. н., проф. Г.Г. Чичканов; д. б. н. И.Б. Цорин

Введение

На протяжении длительного времени исследователи, занимающиеся созданием новых средств для лечения больных ишемической болезнью сердца (ИБС), обращали основное внимание на поиск веществ, способных устранять или предупреждать приступы стенокардии. Однако ИБС, которая возникает вследствие несоответствия между потребностью миокарда в кислороде и возможностями кровоснабжения (следовательно, и снабжения кислородом) его отдельных областей, не обязательно сопровождается приступами стенокардии, а может проявляться в виде безболевых («немых») эпизодов ишемии миокарда. Такие эпизоды по данным суточного мониторирования наблюдаются более чем у половины больных с типичной стенокардией напряжения. При этом они имеют место чаще у больных с поражениями нескольких ветвей коронарной артерии. По данным клиницистов у больных с подтвержденным диагнозом ИБС из всех регистрируемых у них эпизодов ишемии миокарда в течение суток около 3/4 могут носить безболевой характер, а у 4–5% больных ИБС заболевание может вообще протекать бессимптомно [11].

Вот почему для лечения больных ИБС необходимы не только и даже не столько вещества с антиангинальными свойствами, т.е. купирующие болевой приступ, сколько препараты, улучшающие функциональное состояние самого очага ишемии сердечной мышцы, т.е. обладающие выраженным противоишемическим действием.

Перед специалистами, занимающимися поиском такого рода средств, стоят большие трудности. В самом деле на современном этапе наших знаний о патогенезе ИБС, клинике и терапии этого заболевания, учитывая разнообразие форм ИБС, стадии ее развития, речь не может идти о создании какого-либо одного «идеального» антиангинального препарата. И если еще в 70-х–начале 80-х годов прошлого века пытались найти идеальное вещество типа амиодарона (кордарона), которое было бы способно уменьшать потребление сердцем кислорода, значительно увеличивать коронарный кровоток и при этом не угнетать функцию сердца, обладать антиадренергическим действием [19], то позднее от таких попыток отказались. Сегодня в клинике ИБС находят применение вещества с самым разнообразным механизмом действия.

Выделяют 3 основных группы противоишемических (антиангинальных) средств: органические нитраты, β-адреноблокаторы, антагонисты кальция. Каждая из названных групп неоднородна и ее можно разделить на подгруппы, имеющие особенности в механизме антиангинального (противоишемического) действия. Помимо этих основных групп, важное место в терапии больных ИБС могут занимать вещества с иными фармакологическими свойствами, в частности, активаторы К+ АТФ-чувствительных каналов, антигипоксанты, антиоксиданты, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, препараты, влияющие на равновесие в системе простациклин-тромбоксан, блокаторы If-каналов, ингибиторы Na+/H+ обмена и др. Обладая различными механизмами действия все эти

417

препараты приводят в соответствие потребность сердца в кислороде и его доставку или за счет улучшения коронарного кровообращения, или воздействуя на метаболизм миокарда, уменьшая его потребность в кислороде, или действуя на то и другое.

В связи со сказанным становится очевидным, что поиск новых веществ с противоишемическими (антиангинальными) свойствами уже на ранних стадиях следует проводить, учитывая возможные механизмы их действия

Таким образом, целью исследования является поиск, изучение специфической активности и механизмов действия фармакологических веществ, защищающих миокард от ишемического повреждения (замедляющих переход обратимых изменений в необратимые).

Современную программу поиска и доклинического изучения такого рода средств можно представить следующим образом.

1. Первичная оценка фармакологического вещества

Прежде всего, на этом этапе необходимо определить острую токсичность изучаемых веществ, так как интерес могут представлять только те вещества, у которых эффективные дозы не превышают 0,1LЛД50. С этой целью на мышах или крысах, используя один из общепринятых методов, изучают острую токсичность веществ, рассчитывают ЛД16, ЛД50 и ЛД84 (см.: Методические рекомендации по изучению общетоксического действия ЛС).

Уже на этом этапе можно выявить способность веществ оказывать вазодилатирующее (коронарорасширяющее) действие и/или влиять на энергетический метаболизм миокарда, уменьшая его потребность в кислороде. Однако на сегодняшний день не существует какоголибо одного простого, легко воспроизводимого метода, который бы дал определенный ответ на вопрос о перспективности вещества в качестве противоишемического (антиангинального) средства. Как ни привлекательно было бы упростить систему первичного отбора такого рода средств, сделать это не представляется возможным. По сути дела, на сегодня при первичной оценке вещества остается незаменимым общепринятый метод регистрации коронарного кровотока на целом животном (кошки, собаки) по оттоку крови из коронарного синуса, который дает наиболее полный ответ на вопрос о влиянии препарата на такие важные показатели состояния ССС, как артериальное давление, тонус коронарных артерий, величину тотального коронарного кровотока и поглощения сердцем кислорода (которое прямопропорционально произведению артерио-венозной разницы оксигемоглобина или напряжения кислорода и коронарного кровотока), т.е. именно те показатели, которые и определяют соответствие потребности сердца в кислороде и его доставки.

Перспективным будет считаться вещество, которое увеличивает содержание оксигемоглобина (напряжение кислорода) в крови коронарного синуса. При этом объемная скорость коронарного кровотока может, как увеличиваться, так и уменьшаться. Важно, чтобы при увеличении коронарного кровотока поглощение сердцем кислорода уменьшалось или не изменялось. Оно может также увеличиваться, но в значительно меньшей степени, чем увеличивается при этом коронарный кровоток. При уменьшении коронарного кровотока под влиянием исследуемого вещества, поглощение сердцем кислорода должно уменьшаться в значительно большей степени, чем коронарный кровоток [6].

Эксперименты проводят на наркотизированных (этаминал-натрий 40 мг/кг или уретан+хлоралоза 600+40 мг/кг) кошках массой тела 2,5–4 кг в условиях открытой грудной клетки и искусственного дыхания. Венечный синус катеризируют и шунтируют с яремной веной, пропуская кровь через специальную капельницу. Объемную скорость оттока крови из коронарного синуса регистрируют с помощью интервалографа. Системное артериальное давление регистрируют электроманометром в сонной или бедренной артерии. Для предотвращения свертывания крови животным вводят гепарин в дозе 1000 ЕД/кг. При регистрации оттока крови из коронарного синуса измеряют содержание оксигемоглобина в коронарной венозной крови. Для этого может быть применен фотоэлектрический метод с использованием оксигемографа. Кровь, оттекающая из коронарного синуса, прежде, чем пройти через капельницу интервалографа, проходит через кювету оксигемографа.

418

Используя процентное содержание оксигемоглобина в коронарной венозной крови, рассчитывают количество О2, поглощаемого сердцем по следующей формуле:

А = 0,0134 (С1 – С2) × V × H,

где А — количество О2 в мл/мин, С1 — содержание оксигемоглобина в артериальной крови, в % (в среднем (95%), С2 — содержание оксигемоглобина в крови, оттекающей из коронарного синуса, в %, V — объемная скорость оттока крови из коронарного синуса, в мл/мин, Н — количество оксигемоглобина в 1 мл крови, в граммах, определяемое любым из общепринятых методов.

Среднее АД рассчитывают по Карпману [7]: АДср=АДдиаст.+ 0,43 × (АДсист– АДдиаст.). Вместо определения содержания оксигемоглобина можно измерять напряжения кис-

лорода в артериальной и коронарной венозной крови полярографическим методом с помощью электрода Кларка.

В случае невозможности использования вышеописанного метода может быть проведено исследование влияния веществ на двойное произведение (систолическое АД × ЧСС), которое является косвенным показателем потребности миокарда в кислороде [38]. Перспективное противоишемическое средство должно уменьшать этот показатель. Для его измерения проводят эксперименты на наркотизированных (уретан 1000–1300 мг/кг или этаминал-натрий 60 мг/кг, в/б) крысах массой 250–300 г. Регистрируют ЭКГ во II стандартном отведении (любой электрокардиограф с разверткой не менее 100 мм/сек и усилением не менее 20 мм/мВ), АД измеряют в сонной или бедренной артерии электроманометром. Рассчитывают частоту сокращений сердца, среднее АД, двойное произведение.

Исследуемые вещества вводят внутривенно или внутрибрюшинно. Наблюдения проводят в течение 30–60 мин. В ходе экспериментов отбирают 2–3 наиболее активных вещества, для которых определяют диапазон эффективных доз.

Полученные данные обрабатывают статистически. Нормальность распределения проверяют с помощью критерия Шапиро-Уилкса. Если распределение нормальное и дисперсии выборок приблизительно равны (проверка при помощи распределения Фишера), то дальнейшую обработку проводят с помощью дисперсионного анализа для повторных измерений и одного из методов множественных сравнений (Стьюдента с поправкой Бонферони, Даннета и др.). В том случае, если отклонения от условий применения дисперсионного анализа велики, следует использовать непараметрический дисперсионный анализ по Фридману с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Даннету или с помощью ранговых сумм Фридмана [15, 4].

Для дальнейших исследований подбирается препарат сравнения, в качестве которого используется ЛС, обладающее антиангинальными (противоишемическими) свойствами и имеющее механизм действия, близкий к тому, который предполагается у изучаемого ряда веществ.

Отбор противоишемических (антиангинальных) средств на «более простых» моделях (изолированные сосуды сердца, изолированные перфузируемые сердца различных видов животных) по трудоемкости, прогнозируемости, точности оценки, стоимости работы не может в полной мере заменить вышеназванные методы исследования.

2. Изучение противоишемического действия отобранного вещества на различных моделях острой и хронической ишемии миокарда

2.1. Модель острой ишемии миокарда, вызванной временной полной окклюзией передней нисходящей ветви левой коронарной артерии

в течение 5 минут с последующей реперфузией

Исследования проводят на наркотизированных (этаминал-натрий 40 мг/кг, в/в) кошках или собаках в условиях открытой грудной клетки и искусственного дыхания. Груд-

419

ную клетку вскрывают в 4–5 межреберье слева. После рассечения перикарда выделяют небольшой (1,0–1,5 мм) участок передней нисходящей ветви левой коронарной артерии или ее веточки, на который помещают специальный зажим, позволяющий атравматично и полностью закрывать просвет артерии. В зоне ишемии помещают 3–4 зпикардиальных электктрода. Окклюзия венечного сосуда в течение 5 мин сопровождается выраженным подъемом сегмента SТ на эпикардиальной электрограмме, для регистрации которой можно использовать любой многоканальный электрокардиограф. Реперфузия приводит к быстрому и полному восстановлению электрограммы. Как показали исследования, 2-я-6-я окклюзии коронарной артерии (с интервалами между окклюзиями в 15 мин, когда проводится реперфузия), как правило, приводят к стабильному по величине подъему сегмента ST на эпикардиальной электрограмме. Поэтому в каждом эксперименте проводят 3-кратную пятиминутную контрольную окклюзию венечного сосуда. Реперфузия после каждой окклюзии продолжается 15 мин.

Препараты вводят внутривенно или внутрибрюшинно. Окклюзии венечного сосуда проводят через 5, 25, 45 и 65 мин после введения препарата.

О противоишемическом действии фармакологического вещества судят по снижению средней величины подъема сегмента ST на множественных отведениях эпикардиальной электрограммы. Вещество с возможным противоишемическим (антиангинальным) действием будет снижать среднюю величину подъема сегмента ST на электрограмме [18, 37]. Оценку противоишемического действия можно также проводить, регистрируя региональную сократительную функцию миокарда во время окклюзии и реперфузии коронарной артерии, с помощью тензорезисторов или ультразвуковых кристаллов [24, 27]. Вещество с противоишемическим действием будет уменьшать угнетение сократимости, вызываемое ишемией, и/или улучшать ее восстановление во время реперфузии. В этих же экспериментах можно изучать влияние веществ на увеличение содержания лактата в крови коронарного синуса, вызываемое ишемией [37]. Пробы крови (1,5–2) мл забирают из коронарного синуса через катетер до и в конце 5 минуты окклюзии, депротеинизируют, содержание лактата определяют ферментативным (лактатдегидрогеназным) методом [10]. Рассчитывают прирост лактата за время окклюзии. Пробы после депротеинизации можно хранить при –20 С.

Полученные данные обрабатывают статистически. Значимость различий определяют при помощи непараметрического дисперсионного анализа по Фридману с последующей обработкой с помощью критерия Даннета или с использованием множественных сравнений с помощью ранговых сумм Фридмана. Для обработки данных по приросту содержания лактата в коронарной венозной крови при соблюдении необходимых условий может быть применен обычный дисперсионный анализ для повторных измерений с дальнейшим использованием методов множественных сравнений (Стьюдента с поправкой Бонферони, Даннета, Дункана и др.) [4, 15, 9].

2.2. Модель острой ишемии миокарда, вызванной стенозом передней нисходящей ветви левой коронарной артерии

и навязыванием сердцу высокого искусственного ритма

Исследования проводятся на наркотизированных (этаминал-натрий,40 мг/кг, в/в) собаках массой 10–20 кг в условиях искусственного дыхания. Грудную клетку вскрывают в 4–5-м межреберье слева. Выделяют участок передней нисходящей ветви левой коронарной артерии, на который помещают специальный миниатюрный винтовой зажим, дающий возможность дозировано уменьшать просвет артерии (рис.1). Навязывание искусственного ритма

420