3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

специфического фермента, АДГ или АЛДГ. Дополняя друг друга, результаты этих исследований дают возможность оценить эффективность изучаемых веществ в отношении процессов, связанных с действием этанола.

Учитывая определяющую роль АДГ и АЛДГ в регуляции уровней содержания алкоголя в организме, интерпретация полученных данных может рассматриваться с позиций подавления или активации функций указанных ферментов. В случае активации АДГ можно рассчитывать на ускорение метаболизма этанола (например, уменьшение продолжительности алкогольного наркоза или ослабление действия этанола в условиях алкогольной комы). При активации под влиянием изучаемых веществ функции АЛДГ можно предположить ускоренную деградацию ацетальдегида и, тем самым, ослабление проявлений токсических эффектов метаболита этанола, с которым связывают основные проявления алкогольной абстиненции. В качестве препаратов сравнения могут быть использованы пиразол (ингибитор АДГ) и дисульфирам (ингибитор АЛДГ).

Заключение

Алгоритм скрининга фармакологических веществ по выявлению у них возможных «противоалкогольных» свойств

До проведения исследований по выявлению возможных средств для лечения экспериментального алкоголизма и его патологических проявлений следует иметь в виду, что в эксперимент могут быть взяты только вещества, у которых их эффективные дозы не должны превышать 1/20 от ЛД50. Перед началом экспериментов желательно иметь сведения об известных фармакологических свойствах веществ, взятых для исследования, что поможет спланировать последовательность проведения скрининга по тестам, представленным в Методических рекомендациях, или усомниться в целесообразности осуществления указанных исследований.

Первичный скрининг

Первичный скрининг представляет собой необходимые и достаточные исследования, которых позволяют выявить элементы возможной «противоалкогольной» активности у изучаемых веществ и оценить перспективы проведения дальнейшего более подробного их изучения.

А. Выявление свойств, ослабляющих тяжелую алкогольную интоксикацию

Влияние фармакологических веществ на различные уровни алкогольной интоксикации у животных в условиях свободного поведения.

Влияние фармакологических веществ на различные уровни алкогольной интоксикации у животных в условиях алкогольного наркоза, при алкогольной коме и на выживаемость при субтоксических дозах этанола.

Б. Выявление средств для купирования негативных последствий у животных, перенесших острую алкогольную интоксикацию.

В. Выявление фармакологических веществ, влияющих на процесс формирования алкогольной мотивации при «субхроническом» использовании этанола.

Г. Выявление фармакологических веществ, влияющих на активность этанол-мета- болизирующих систем (пункты 9.1–9.2.).

Расширенные исследования

Направлены на проведение подробного изучения «противоалкогольных» свойств веществ, выявленных на этапе первичного скрининга, с помощью методов, позволяющих оценить указанные свойства на экспериментальных моделях алкогольной зависимости, абстиненции, восстановления алкогольной мотивации после лишения доступа к этанолу, толерантности, нарушений структуры сна в этих условиях.

Каждая из перечисленных моделей может составить предмет отдельного исследования, если экспериментатор намерен ограничиться рассмотрением конкретной связанной с алкоголизмом позиции, обозначенной в представленных Методических рекомендациях.

331

Таким образом, в случае выявления позитивных «противоалкогольных» эффектов у исследуемых веществ, полученные данные позволят на доклиническом уровне очертить возможные показания к их использованию и оценить потенциальную перспективу клинического применения этих веществ в качестве средств для лечения алкоголизма у людей.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Garbutt J.C., West S.L., Carey T.S., Lohr K. N., Crews F.T. Pharmacological Treatment of Alcohol Dependence. AReviewofthe Evidence JAMA. 1999; 281: 1318–1325.

2.Приказ по МЗ СССР № 63 от 10 марта 1966 г. «О нормах кормления лабораторных животных и продуцентов».

3.Goodwin F.L., Amir S., Amit Z. Environmental lighting has a selective influence on ethanol intake in rats. PhysiolBehav, 1999 ; 66(2): 323–8.

4.Буров Ю.А., Ведерникова Н.Н. Экспериментальное моделирование алкоголизма. В кн.: Нейрохимия и фармакология алкоголизма. М.: Медицина, 1985. — С. 5–42.

5.Sprague J.E., Maickel R.P. E ects of stress and ebiratide (Hoe-427) on free-choice ethanol consumption: comparison of Lewis and Sprague-Dawleyrats. Life Sci, 1994; 55(11): 873–8.

6.Parker L.F., Radow B.L. Isolation stress and volitional ethanol consumption in the rat.Physiol Behav, 1974 Jan; 12(1): 1–3.

7.Кампов-Полевой А.Б. Изучение особенностей формирования алкогольной мотивации у крыс. — В кн.: Фармакология экспериментального алкоголизма/Под ред.Ю.В. Бурова. М., 1982, С. 130–135.

8.Mardones J., Segovia-Riquelme N. Thirty-two years of selection of rats by ethanol preference: UChA and UChBstrains. Neurobehav Toxicol Teratol, 1983 Mar-Apr; 5(2): 171–8.

9.Metten P., Best K.L., Cameron A.J. et al. Observer-rated ataxia: rating scales for assessment of genetic di erences in ethanol-induced intoxication in mice. J ApplPhysiol 2004; 97: 360–368.

10.Rustay N.R., Wahlsten D., Crabbe J.C. Assessment of genetic susceptibility to ethanol intoxication in mice. ProcNatlAcadSci U S A. 2003; 100(5): 2917–22.

11.Moore E.M., Serio K.M., Goldfarb K.J. et al. GABAergic modulation of binge-like ethanol intake in C57BL/6J mice. Pharmacol Biochem Behav. 2007; 88(1): 105–113.

12.Майский А.И., Салимов Р.М. Методические указания по изучению препаратов для лечения алкоголизма. В кн. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под ред. Р.У. Хабриева). — М., 2005. — C. 342–356.

13.Буров Ю.В., Жуков В.Н., Кампов-Полевой А.Б. Методические рекомендации по экспериментальному (фармакологическому изучению препаратов, предлагаемых для клинической апробации в качестве средств для лечения и профилактики алкоголизма. — М., 1980. — С. 1–21.

14.Rhodes J.S., Best K., Belknap J.K., Finn D.A., Crabbe J.C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. PhysiolBehav. 2005; 84(1): 53–63.

15.Hendrickson L.M., Zhao-Shea R., Tapper AR. Modulation of ethanol drinking-in-the dark by mecamylamine and nicotinic acetylcholine receptor agonists in C57Bl/6J mice. Psychopharmacology (Berl). 2009; 204(4): 563–72.

16.Blednov Y.A. and Harris R.A. Metabotropic glutamate receptor 5 (mGluR5) regulation of ethanol sedation, dependence and consumption: relationship to acamprosate actions. Int J Neuropsychopharmacol. 2008; 11(6): 775–793.

17.Kamdar N.K., Miller S.A., Syed Y.M., Bhayana R., Gupta T., Rhodes J.S. Acute e ects of naltrexone and GBR 12909 on ethanol drinking-in-the-dark in C57BL/6J mice. Psychopharmacology (Berl). 2007; 192(2): 207–17.

18.Spanagel R. & Holter S.M. Pharmacological validation of a new animal model of alcoholism. J.Neural. Transm. 2000; 107, 669–680.

19.Cicero TJ, Snider SR, Perez VJ, Swanson LW. Physical dependence on and tolerance to alcohol in the rat. Physiol Behav. 1971 Feb; 6(2): 191–8.

332

20.Crabbe J.C., Metten P., Rhodes J.S., Yu C.H., Brown L.L., Phillips T.J., Finn D.A. A line of mice selected for high blood ethanol concentrations shows drinking in the dark to intoxication. Biol Psychiatry. 2009 Apr 15; 65(8): 662–70.

21.O’Dell L.E., Roberts A.J., Smith R.T., Koob G.F. Enhanced alcohol self-administration after intermittent versus continuous alcohol vapor exposure. Alcohol Clin Exp Res 2004; 28: 1676–168.

22.Roberts A.J., Heyser C.J., Koob G.F. Operant self-administration of sweetened versus unsweetened ethanol:E ects on blood alcohol levels. Alcohol Clin Exp Res 1999; 23: 1151–1157.

23.Gilpin N.W., Richardson Р.N., Cole М., and Koob G.F. Vapor Inhalation of Alcohol in Rats. Curr Protoc Neurosci. 2008 July ; Chapter 9: Unit9. 29.

24.Besheer J., Lepoutre V., and Hodge C.W. Preclinical Evaluation of Riluzole: Assessments of Ethanol SelfAdministration and Ethanol Withdrawal Symptoms. Alcohol Clin Exp Res. 2009; 33(8): 1460–1468.

25.Крушинский Л.В. Формирование поведения животных в норме и патологии. — М.: Изд-во МГУ, 1960. — C. 264.

26.Rogawski M.A. Update on the Neurobiology of Alcohol Withdrawal Seizures. EpilepsyCurrents. 2005; 5(6): 225–230.

27.Rassnick S., Koob G.F., Geyer M.A. Responding to acoustic startle during chronic ethanol intoxication and withdrawal. Psychopharmacology (Berl). 1992; 106(3): 351–8.

28.Chester J.A., Blose A.M., Froehlich J.C. E ects of chronic alcohol treatment on acoustic startle reactivity during withdrawal and subsequent alcohol intake in high and low alcohol drinking rats. Alcohol Alcohol. 2005; 40(5): 379–87.

29.Holter S. M., Spanagel R. E ects of opiate antagonist treatment on the alcohol deprivation e ect in long-term ethanol-experienced rats. Psychopharmacology. 1999; 145: 360–369.

30.Heyser C.J., Schulteis G., Durbin P., Koob G.F. Chronic acamprosate eliminates the alcohol deprivation e ect while having limited e ects on baseline responding for ethanol in rats. Neuropsychopharmacology. 1998; 18: 125–133.

31.Le AD., Shaham Y. Neurobiology of relapse to alcohol inrats.Pharmacology&Theurapeutics. 2002; 94: 137–156.

32.Stewart J. Pathways to relapse: the neurobiology of drugand stress induced relapse to drug-taking. J Psychiatry Neurosci. 2000; 25, 125–136.

33.Le A.D., Poulos C.X., Harding S., Watchus W., Juzytsch W., Shaham Y. E ects of naltrexone and fluoxetine on alcohol self administration and reinstatement of alcohol seeking induced by priming injections of alcohol and exposure to stress in rats. Neuropsychopharmacology. 1999; 21, 435–444.

34.Katner, S. №., & Weiss, F. Ethanol-associated olfactory stimuli reinstate ethanol-seeking behavior after extinction and modify extracellular dopamine levels in the nucleus accumbens. Alcohol ClinExp Res. 1999; 23: 1751–1760.

35.Le A.D., Quan B., Juzystch W., Fletcher P.J., Joharchi N., Shaham Y. Reinstatement of alcoholseeking by priming injections of alcohol and exposure to stress in rats. Psychopharmacology. 1998; 135, 169–174.

36.Bienkowski P., Kostowski W., Koros E. Ethanol-reinforced behaviour in the rat: e ects of naltrexone. Eur J Pharmacol. 1999; 374: 321–327.

37.Burattini C., Gill T.M., Aicardi G., Janak P.H. The ethanol self-administration context as a reinstatement cue: acute e ects of naltrexone. Neuroscience. 2006; 139(3): 877–87.

38.Viglinskaya I.V. Experimental approaches to the evaluation of alcohol abuse and dependence development.Drug Alcohol Depend. 1992; 30(2): 111–5.

39.De Groot J. The Rat Forebrain in Stereotaxic Coordinates. N.V. Noord-Hollandsche Uitgevers. Maatschappu-Amsterdam, 1959.

40.Dennis R. Sparta, Angela M. Sparrow, Emily G. Lowery, Jon R. Fee, Darin J. Knapp, and Todd E. Thiele Blockade of the Corticotropin Releasing Factor Type Receptor Attenuates Elevated Ethanol Drinking Associated With Drinking in the Dark Procedures. Alcohol Clin.Exp Res. 2008; 32(2): 259–265.

41.Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72, 248–54.

42.Chang T.K., Crespi C.L., Wa[man] D.J. Spectrophotometric analysis of human CYP2E1-catalyzed p-nitrophenol hydroxylation. Methods Mol.Biol. 1998; 107, 147–52.

43.Lumeng L., Bosron W.F., Li T.K. Rate-determining factors for ethanol metabolism in vivo during fasting. Adv.Exp Med.Biol, 1980; 132: 489–496.

44.Lindros K.O., Badger T., Ronis M., Ingelman-Sundberg M., Koivusalo M. Phenethylisothiocyanate, a new dietary liver aldehyde dehydrogenase inhibitor. J Pharmacol. ExpTher. 1995; 275(1): 79–83.

333

ГЛАВА 20

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ МЕСТНОАНЕСТЕЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: академик РАМН Ю.Д. Игнатов; к. м. н. В.А. Волчков; член-корр. РАМН П.А. Галенко-Ярошевский; к. м. н. А.Н. Кубынин; к. м. н. К.Н. Мельников; д. м. н., проф. Ю.Р. Шейх-Заде

Введение

Исходя из потребностей клиники, в последнее время все большее значение приобретает изыскание новых местноанестезирующих средств (МС) и их лекарственных форм пролонгированного действия. Актуальность и перспективность создания пролонгированных МС определяется их использованием для лечения хронических болевых синдромов, в послеоперационном периоде, при транспортировке больных и т.д.

Многие из МС проявляют активность практически при всех видах местной анестезии. Однако данные экспериментальных исследований и практика местной анестезии у людей показывают, что у ряда веществ местноанестезирующая активность (МА) может быть неодинаковой при разных видах анестезии. Так, некоторые МС, высокоактивные при инфильтрационной и проводниковой анестезии, оказываются малоактивными при терминальной, поскольку плохо проникают через кожу и слизистые оболочки. В связи с этим одним из требований, предъявляемых к МС, является достаточная активность, обеспечивающая в условиях определенного вида анестезии (терминальной, инфильтрационной, проводниковой) возможное проведение безболезненного хирургического вмешательства и различных врачебных манипуляций.

Практический опыт местной анестезии свидетельствует, что МС обладают токсичностью, которая, как правило, возрастает параллельно с ростом МА и складывается из проявлений их резорбтивного действия (наиболее опасные — воздействие на ЦНС и кардиодепрессорные эффекты) и местнораздражающих эффектов вплоть до некробиотического действия.

1. Критерии оценки местноанестезирующего эффекта

Одной из главных характеристик, подлежащих оценке в процессе скрининга новых соединений, является характеристика их МА, отражающая величины основных специфических проявлений фармакологического эффекта: глубины (силы) анестезии, скорости наступления анестезии и ее продолжительности. Эти показатели рассматриваются в качестве главных критериев оценки вещества в эксперименте.

Глубина местноанестезирующего эффекта — вызываемое веществом ослабление ноцицептивной (болевой) реакции (вплоть до ее полного исчезновения) в сравнении с исходными значениями этой реакции в ответ на ноцицептивную стимуляцию участка ткани, на который локально воздействует вещество. Глубина эффекта оценивается по обусловленным веществом изменениям показателя величины внешних стимулов, вызывающих пороговое проявление болевой реакции, и чаще всего выражается в процентах от исходных (фоновых) значений этого показателя, или в иных единицах, характеризующих его изменения.

Скорость наступления анестезии — интервал времени между введением или нанесением на поверхность изучаемого вещества и началом проявления его МА. Латентный пе-

334

риод действия МС зависит от способа их введения и является наибольшим при аппликации вещества на кожные покровы или слизистые оболочки. У большинства препаратов эффект развивается в пределах нескольких минут.

Продолжительность анестезии — период времени от момента развития местной анестезии до ее исчезновения. При проведении скрининга новых соединений необходимо учитывать, что продолжительность действия не может быть беспредельной и во всех случаях необходимо добиваться полного восстановления чувствительности. Поэтому при исследовании новых веществ пролонгированного действия особого внимания требует выбор адекватных моделей, которые позволяют достоверно оценивать МА в течение длительного периода времени. При изучении МС длительного действия целесообразно увеличивать интервалы времени между повторными тестированиями эффекта, что позволит снизить трудоемкость исследования.

При экспериментальной оценке МС в зависимости от выбранного метода исследования используют определенные показатели, количественно отражающие их активность: ЭК50 и ЭК100 — средние эффективные концентрации вещества, вызывающие соответственно 50-процентный и 100-процентный эффекты; МЭК — минимальные эффективные концентрации, вызывающие местноанестезирующее действие; ЭД50 и ЭД100 — средние эффективные дозы, отражающие количество вещества (в мг) в 1 мл раствора или на 1 кг массы животного, вызывающее соответственно 50-процентный и 100-процентный местноанестезирующие эффекты.

Наряду с исследованием МА новых соединений необходимо оценивать выраженность их местнораздражающего и резорбтивного действия (ЛД50 — средняя летальная доза, отражающая количество вещества, вызывающее гибель 50% животных). При этом следует учитывать, что новые соединения в концентрациях, предлагаемых для клинического применения, не должны обладать местнораздражающим эффектом. При рассмотрении токсикологических характеристик и активности нового вещества следует иметь в виду, что в практическом отношении интерес могут представлять только те соединения, терапевтическая широта которых существенно больше, чем у эталонных препаратов.

2. Значение некоторых физико-химических характеристик новых соединений при скрининге МА

Известно, что активность МС зависит от ряда их физико-химических свойств. Между такими физико-химическими свойствами МС, как растворимость в воде, величина рН раствора, липофильность, способность к распределению в ткани, поверхностная активность, способность к абсорбции, влияние на проницаемость ионных каналов мембраны и их анестезирующими свойствами существует симбатная зависимость.

Некоторые характеристики физико-химических свойств веществ, имеющие наиболее важное значение для начальных этапов исследования.

Растворимость. Для скрининга МС прежде всего необходимо выбирать водорастворимые соединения, поскольку именно растворы местных анестетиков наиболее широко применяются в клинике. Однако и малорастворимые в воде соединения могут представлять определенный интерес для создания средств для терминальной анестезии, но в соответствующей лекарственной форме.

рН раствора. Большинство МС являются хлористоводородными солями, растворы которых наиболее стабильны при рН 3,5–6,0. Так как все МС являются основаниями, то при сдвиге рН в сторону более высоких значений увеличивается концентрация свободного основания в соответствии с их значениями рКа, в результате чего возрастает их проникающая способность. При низких значениях рН активность соединений, как правило, уменьшается, и при этом возможно появление или усиление их местнораздражающего действия. Поэтому большие отклонения рН опытных растворов от рН изотонического раствора натрия хлорида могут повлиять на результаты исследования, особенно при изучении МА на изолированных нервах и на моделях терминальной анестезии.

335

Концентрация растворов. Скрининг МС целесообразно проводить в растворах тех концентраций, в которых применяются эталонные препараты: для терминальной анестезии в интервале от 0,25% до 2–5%, для инфильтрационной и проводниковой — от 0,125 % до 1–2%. При этом начинать исследование следует с 1% растворов и в зависимости от полученных результатов, отражающих активность и местнораздражающее действие нового соединения, проводить последующее изучение свойств препаратов в более высоких или более низких концентрациях.

Наиболее ценным показателем при сравнении исследуемого вещества с эталонным препаратом является сопоставление их в эквиэффективных концентрациях (процентных и молярных). Соотношение токсической и эффективной доз (ЛД50/ЭД50, терапевтический индекс) изучаемого вещества позволяет представить его терапевтическую широту и определить максимально возможный безопасный объем вводимого раствора в конкретной эффективной концентрации.

В исследованиях, в которых выявляется зависимость «доза–эффект» может быть определена минимальная эффективная концентрация, а также время достижения максимальной эффективной концентрации, отражающее фармакокинетические характеристики препарата.

3.Задачи и прогностическое значение методов первичного скрининга

иуглубленного изучения местных анестетиков

Исследования, проводимые в рамках скрининга МС, могут быть подразделены на три этапа: альтернативное выявление местноанестезирующего эффекта, первичный скрининг и углубленное изучение.

Альтернативное выявление местноанестезирующего эффекта новых соединений предполагает использование простейших методов, позволяющих осуществить ориентировочный отбор соединений, представляющих интерес для дальнейшего изучения. С этой целью могут использоваться методы, подробно изложенные в различных руководствах (20, 25, 33), включая практикумы для студентов медицинских ВУЗов. Большинство этих методов позволяет установить только сам факт МА у нового соединения. В случае положительного результата необходимо проведение более детального исследования на моделях первичного скрининга.

Первичный скрининг — позволяет изучить активность новых соединений при различных видах анестезии, определить скорость развития и продолжительность действия в сравнении с эталонными препаратами, выявить местнораздражающие и резорбтивные эффекты и рассчитать терапевтическую широту. Методы первичного скрининга должны отличаться простотой выполнения, экономичностью и большой «пропускной» способностью.

Углубленное изучение — проводят на последних этапах доклинического исследования новых соединений, у которых была выявлена достаточная МА. На этапе углубленного изучения используют методы, моделирующие потенциальное применение препарата в клинических условиях по предлагаемому целевому назначению.

4. Выбор эталонных препаратов при скрининге местных анестетиков

Большинство МС обладает активностью при всех видах местной анестезии. Однако на практике используется принцип относительно специализированного применения отдельных препаратов для каждого вида анестезии. В соответствии с этим при скрининге новых МС необходимо дифференцированно подходить к выбору «эталонных» препаратов — препаратов сравнения.

Для терминальной (поверхностной, аппликационной) анестезии в клинике преимущественно применяют бензокаин (анестезин), тетракаин (дикаин), бумекаин (пиромекаин) и лидокаин. В качестве «эталонного» препарата для данного вида анестезии при исследовании водорастворимых веществ следует использовать тетракаин (дикаин). Ди-

336

каин — высокоактивный препарат при анестезии слизистых оболочек, но он высокотоксичен. Следовательно, при создании новых средств для этого вида анестезии перспективным будет изыскание соединений, равных или превышающих по активности дикаин, обладающих длительным эффектом и значительно менее токсичных.

Из применяемых в настоящее время в Российской Федерации анестетиков в наибольшей степени удовлетворяют требованиям инфильтрационной анестезии тримекаин, лидокаин и артикаин (ультракаин). Однако их существенным недостатком является относительно небольшая продолжительность действия и сравнительно высокая токсичность, которая в два и более раза превышает таковую у прокаина (новокаина). Поэтому для этого вида анестезии также необходим поиск веществ, по активности и продолжительности действия превышающих тримекаин, лидокаин и артикаин, но более безопасных.

В качестве «эталонных» препаратов для проводниковой и спинномозговой анестезии следует использовать бупивакаин (маркаин), ропивакаин (наропин), или менее активные артикаин, лидокаин, тримекаин. Бупивакаин вызывает длительную (до 8 и более ч) анестезию, но при его применении могут наблюдаться проявления нежелательного резорбтивного действия. В связи с этим необходимо изыскание новых соединений, менее токсичных и не уступающих по силе и продолжительности эффекта бупивакаину.

5. Исследование местноанестезирующей активности соединений на различных моделях

Учитывая, что МС применяются при различных видах местной анестезии, для скрининга новых соединений необходимо использовать методы, моделирующие поверхностную, инфильтрационную, проводниковую, эпидуральную и спинномозговую анестезию.

5.1.Модели поверхностной (терминальной) анестезии

5.1.1.Комбинированное (одновременное) выявление поверхностной местноанестезирующей активности вещества на роговице глаза кролика

по методу Regnier и его местнораздражающего действия по методу Setnicar

В исследовании используют наркотизированных кроликов-самцов массой 2,0–2,5 кг. Кролика помещают в специальный ящик с отверстием, фиксирующим голову. Определяют порог чувствительности роговицы глаза кролика к тактильному воздействию. С этой целью применяют различные приспособления. Ренье рекомендовал конский волос, другие исследователи предпочитают нейлоновую нить (леску), конец которой оплавляют в пламени горелки до сгибания, или стеклянную палочку с шарообразным окончанием диаметром 1,5 мм, или тонкую металлическую проволоку с окончанием в виде петли. При проведении исследований необходимо использовать одно стандартное приспособление, в наименьшей степени травмирующее роговицу.

Исходную чувствительность роговицы глаза кролика (контроль) определяют дважды с интервалом в 5 мин (ресницы перед исследованием отстригают). Раствор исследуемого вещества в объеме 0,4 мл инстиллируют в конъюнктивальный мешок глаза кролика за 2 раза с интервалом 30 с. Первое определение поверхностной анестезии проводят на 8-й минуте исследования и повторяют на 10, 12, 15, 20, 25, 30-й и т.д. мин исследования. Каждый раз отмечают минимальное число прикосновений одинаковой силы и ритма, вызывающее смыкание век.

Каждую концентрацию вещества проверяют 8 раз, используя роговицу разных глаз. За индекс Ренье, характеризующий степень анестезии, принимают среднюю величину, вычисленную из суммы величин, полученных при исследовании исследуемого вещества в течение 60 мин (13 временных точек). Отсутствие мигательного рефлекса в течение 1 мин (100 прикосновений) расценивают как показатель полной анестезии. Максимальный индекс Ренье для высокоактивных веществ равен 1300, минимальный — 13, для неактивных соединений.

337

Исходя из полученных данных, отражающих изменения чувствительности роговицы под воздействием МС, определяют начало (для активных веществ с 1-й мин после введения), длительность полной (100%) анестезии, общую длительность МА. При определении длительности анестезии, вызываемой высокоактивными соединениями, исследования можно продолжать до 120 мин и более.

Относительную активность исследуемых соединений высчитывают по уравнению Валетта (Valette) (20).

где Y — концентрация эталонного препарата, при которой его индекс Ренье соответствует индексу Ренье (x) изучаемого соединения в изучаемой концентрации; Т — концентрация раствора эталонного препарата, индекс Ренье которой превышает индекс Ренье (x) изучаемого соединения; t — концентрация раствора эталонного препарата, индекс Ренье которой меньше индекса Ренье (x) изучаемого соединения; N — индекс Ренье для Т; n — индекс Ренье для t; x — индекс Ренье изучаемого соединения в изучаемой концентрации.

Пример расчета относительной активности исследуемого вещества по сравнению с тетракаином:

Индекс Ренье 1% раствора исследуемого вещества x = 336. Индекс Ренье 0,05% раствора тетракаина T = 480.

Индекс Ренье 0,025% раствора тетракаина t = 320.

Эквивалентная концентрация тетракаина (Y), при которой индекс Ренье тетракаина равен индексу Ренье 1% раствора изучаемого соединения, будет составлять:

Y = 0,05×(336−320)+0,025×(480−336) = 0,0275%. 480−320

При сравнении эквивалентной концентрации тетракаина (Y = 0,0275%) и исследуемого соединения видно (1%), что тетракаин при поверхностной анестезии более чем в 36 раз превосходит исследуемое соединение. Следовательно, относительная активность исследуемого соединения составляет только около 0,03 от активности тетракаина, принятой за единицу.

Чувствительность роговицы глаза кроликов может значительно отличаться друг от друга, поэтому рекомендуется предварительно подобрать животных, у которых определенная концентрация эталонного препарата всегда вызывает сходные результаты.

Одновременно с выявлением МА определяют местнораздражающее действие исследуемого вещества на ткани глаза кролика (33).

Для оценки этого действия используется следующая шкала: а) нет видимых изменений (–);

б) гиперемия конъюнктивы и края век, мигательной перепонки в пределах 30 мин, смыкание век не более чем на 5–10 мин после введения вещества (+);

в) гиперемия конъюнктивы век, мигательной перепонки, края век, склеры и инфильтрация (уплотнение) тканей век в течение 30–300 мин (++);

г) гиперемия конъюнктивы век, мигательной перепонки, края век, склеры и инфильтрация, длящаяся более 300 мин (+++).

Обнаружение у изучаемого вещества местнораздражающего действия (++ и более в соответствие с представленными шкалами) свидетельствует о малой перспективности этого вещества.

5.1.2. Изучение местноанестезирующей активности при поверхностной анестезии слизистой оболочки глотки и трахеи кошек

Метод предназначен для изучения МА новых соединений в условиях, моделирующих их возможное применение в области глотки и трахеи, в частности, для проведения эндоскопических манипуляций. Данный метод является модификацией метода изуче-

338

ния активности МС на слизистой оболочке глотки кролика [20]. Выбор кошек в качестве объекта исследования обусловлен особенностями анатомического строения их ротовой полости и глотки, обеспечивающими по сравнению с кроликами и другими мелкими лабораторными животными более широкий доступ к глотке, гортани и трахее.

В эксперименте используют кошек-самцов массой 3,5–4 кг. Изучение активности МС осуществляют на животных, наркотизированных нембуталом (30 мг/кг, внутрибрюшинно). В условиях такого наркоза на протяжении 3–4 ч у кошек полностью сохранены резко выраженные кашлевые рефлексы в ответ на механическую стимуляцию слизистых оболочек: прикосновение кончиком катетера последовательно к дужкам, надгортаннику, голосовой щели, к стенкам трахеи. Положение животного — на спине. Голова кошки с максимально раскрытой пастью вместе с языком фиксируется на прочном пластмассовом кольце с соответствующими пазами для зубов. Это кольцо закрепляют между клыками нижней и верхней челюсти. Кольцо сбоку жестко фиксируют к штативу, получая наиболее удобный обзор и доступ к глотке, гортани и трахее. Затем приступают к фоновому тестированию кашлевых рефлексов кошки последовательно в ответ на механическую стимуляцию глотки, надгортанника, голосовой щели и трахеи. Стимуляцию осуществляют относительно жестким полиэтиленовым катетером с наружным диаметром 3 мм, длиной 14 см с запаянным закругленным концом. На протяжении 3 см от запаянного конца катетер имеет множественные мелкие отверстия по окружности с целью его последующего использования для орошения трахеи раствором изучаемого вещества. Получив исходные (фоновые) характеристики кашлевой реакции, с помощью стандартного пульверизатора с расстояния 5 см от надгортанника орошают слизистую оболочку глотки, надгортанника и входа в гортань, используя 0,5 мл раствора изучаемого МС. Через 5 мин после орошения в трахею вводят упомянутый катетер на глубину 5 см от уровня голосовой щели и через него под давлением с помощью шприца орошают 0,5 мл раствора МС слизистую оболочку трахеи.

Повторное тестирование кашлевого рефлекса выполняют через 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40 мин и т.д. после орошения в полном соответствии с механической стимуляцией, произведенной при фоновом тестировании. Об анестезирующей активности, о начале и длительности местной анестезии судят по способности вещества полностью подавлять кашлевой рефлекс у животного при механическом раздражении.

5.2.Модели инфильтрационной анестезии

5.2.1.Изучение местноанестезирующей активности

при инфильтрационной анестезии у морских свинок по методу Bulbring и Wajda

Исследования проводят на морских свинках-самцах массой 200–250 г. В область спины каждого животного, предварительно удалив с нее волосяной покров, в 4 точках — А, Б, В и Г (по углам квадрата со стороной 3 см) внутрикожно вводят свежеприготовленные изотонические растворы изучаемого соединения и эталонного препарата в объемах 0,25 мл. Растворы целесообразно вводить таким образом, чтобы исследуемое соединение в каждой концентрации инъецировалось в одну переднюю (А) и одну заднюю (Г) точки, а эталонный препарат в соответствующих концентрациях — в точки Б и В. Область введения препарата обводят чернилами. МА оценивают 6–8 раз для каждой из выбранных концентраций. Чувствительность в месте введения определяют прикосновением инъекционной иглой сериями по 6 прикосновений с промежутками 3–4 с, через каждые 5 мин, в течение 30 мин. Суммарное число прикосновений иглы, не вызывающих реакции животного (подергивание кожи) в течение 30 мин, расценивается как индекс инфильтрационной анестезии для раствора МС в данной концентрации. Кроме того, можно определить и среднюю эффективную концентрацию (ЭК50) изучаемого МС, которая представляет собой такую концентрацию, при которой индекс инфильтрационной анестезии равен 18. Определение индексов для растворов каждой концентрации обычно проводят на 3–4 жи-

339

вотных. Исходя из зависимости «доза–эффект», определяют относительную активность исследуемого соединения. При этом на графике по оси ординат наносят индексы инфильтрационной анестезии, а по оси абсцисс — логарифмы исследованных концентраций МС. Результаты исследований сводят в таблицу. В качестве примера см. табл. 1.

Таблица 1 Местноанестезирующая активность прокаина (новокаина) и тримекаина

при инфильтрационной анестезии у морских свинок

Примечание. Представлены средние данные из 8 исследований, со стандартной ошибкой средней.

5.2.2. Изучение местноанестезирующей активности при инфильтрационной анестезии брюшной стенки у кроликов

методом определения порога ноцицепции при электростимуляции

Исследования выполняют на наркотизированных кроликах-самцах массой 2,0–2,5 кг. Кролика фиксируют на станке за лапы в положении на спине. Кожу живота сбоку на уровне средней трети освобождают от волосяного покрова. На платиновые электроды, подключенные к электростимулятору, помещают небольшие ватные тампоны, смоченные в изотоническом растворе натрия хлорида. Электроды закрепляют на брюшной стенке кролика с помощью резинового пояса.

Раздражения наносят прямоугольными импульсами электрического тока длительностью 0,3 мс, частотой 50 Гц, амплитудой от 5 В и выше до появления ответной болевой реакции кролика. Длительность каждого стимула — 2 с. Интервал между стимуляциями равен 1 мин. Показателем болевой реакции является изменение ритма и амплитуды дыхания интактного животного. Регистрацию дыхания осуществляют на самописце с помощью механодатчика, связанного с капсулой Марея, в которую поступает воздух через резиновую трубку, помещенную в один из носовых ходов кролика, или с помощью термодатчика, укрепленного у ноздри на пути выдыхаемого воздуха.

За пороговое раздражение принимают минимальное напряжение электрического тока в вольтах, при котором возникает болевая реакция кролика, сопровождаемая изменением ритма дыхания. Обычно эта величина составляет 10–25 В (фоновое значение). После определения порога болевой реакции животного электроды снимают и отмечают место их расположения на коже, очертив его чернилами. Исследуемое вещество в виде 1% раствора вводят внутрикожно в объеме 0,5 мл и подкожно в объеме 2 мл под электрод с помощью шприца и иглы с наружным диаметром 0,3 мм. Тестирование ноцицептивной реакции в ответ на стимуляцию осуществляют сразу, через 3, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 мин и т.д. после введения вещества. О времени развития анестезии, ее глубине и длительности судят по изменению порога реакции на электрическое раздражение участка кожи, инфильтрированного раствором исследуемого вещества. Глубину анестезии выражают в процентах. За 20% анестезию принимают действие вещества, устраняющее реакцию на пороговое раздражение. Повышение пороговой величины раздражения на 5 В принимают за 40% анестезию, на 10 В — за 60% и т.д. Повышение порога на 20 В условно принимают за 100% анестезию. С каждой концентрацией изучаемого вещества ставят 5 исследований. Высокоактивные вещества проверяют в 0,5%, 0,25% и меньших концентрациях, малоактивные — в 2% и 5% концентрациях. Объем вводимого раствора высокоактивного вещества может быть уменьшен до 1 мл. Результаты исследований заносят в таблицу. В качестве примера см. табл. 2.

340