3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

ческих нейронов (холинотоксин AF-64А, b-амилоид 25-35), либо блокаду холинергических нейронов, например, скополамином.

Эти модели относительно просты и удобны, поскольку позволяют достаточно быстро сымитировать определенное патогенное состояние у получавшего ЛС животного. Главным недостатком данных моделей является то, что они неполноценно отражают реальную картину заболевания. В отличие от БА, когда происходит медленное развитие комплекса взаимосвязанных процессов, в данном случае развитие патогенных процессов происходит резко и быстро и, что наиболее существенно, воспроизводится один компонент патологии, характерной для БА.

В настоящее время такие модели могут быть актуальны на начальных этапах, как предварительные. Они позволяют оценить перспективность дальнейшего изучения потенциального препарата на других, более адекватных моделях.

4.5.5.1. Модель нейродегенеративной патологии при БА с использованием бульбэктомии

Одной из хирургических моделей БА является использование животных с предварительно удаленными обонятельными луковицами. У этих животных регистрируются поведенческие, морфологические и биохимические признаки, сходные с БА. Это проявляется в ухудшении когнитивных функций, гибели нейронов в структурах, ответственных за формирование, хранение и воспроизведение памяти, на фоне повышения уровня мозгового бета-амилоида и нарушения иммунного статуса. Эта модель воспроизводит также дефицит холинергической системы, который является одним из ведущих патогенетических звеньев, ответственных за нарушения памяти при БА [2]. В эксперименте используют мышей линии NMRI, которые были получены из колонии (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA, USA) и находятся в условиях барьерного контроля в специализированном виварии (Пущино, ФИБХ). У животных, находящихся под наркозом, проводят двухстороннее удаление обонятельных луковиц путем их аспирации через трепанационное отверстие в черепе животных, находящихся под наркозом. Ложнооперированные (ЛО) животные подвергались аналогичной процедуре, но без удаления луковиц. Через 4 недели после операции животным вводят тестируемые вещества по следующей схеме: две недели до начала обучения — 1 раз в день, далее в течение недели в ходе обучения — за 1 ч до начала сеанса и далее — за 1 ч перед тестированием памяти. Через 6 недель после операции всех животных тестируют на способность к обучению с использованием водного лабиринта Морриса, УРПИ, УРАИ и др. методов, позволяющих оценить поведение и состояние животных.

4.5.5.2.Методика моделирования холинергического дефицита

укрыс, вызванного скополамином

Учитывая тот факт, что важным патогенетическим фактором болезни Альцгеймера является дефицит холинергической синаптической передачи, в качестве одного из методов моделирования когнитивной патологии, наблюдающейся при этом заболевании, применяется хроническое введение скополамина [17]. Эксперименты выполняются на крысах, случайным образом разделенных на 3 группы. Крысам группы I в течение 20 дней внутрибрюшинно (в/б) ежедневно вводится 0,9% раствор NaCl, крысам II и III групп в течение 20 дней вводится скополамин в дозе 1 мг/кг/день, в/б. С 21-го по 30-й день крысам группы I (пассивный контроль) и группы II (активный контроль) вводится раствор NaCl, а крысам получающей ЛС группы III — тестируемый НП. Через 24 ч после последнего введения 0,9% раствора NaCl или НП проводится тестирование животных с использованием методов, позволяющих оценить обучение и память. Например, проводится выработка УРПИ с тестированием сохранения памятного следа через 24 ч и 30 сут после обучения УРПИ и/или УРАИ, при этом каждому животному дают 20 предъявлений в день в течение 5 дней.

291

4.5.5.3. Модель БА с введением амилоидного пептида 25–35 (Aβ 25–35) в ядра Мейнерта

Известно, что основным компонентом сенильных бляшек при БА является амилоид (1–42). Его нейротоксические эффекты воспроизводятся гидрофобным С-терминальным фрагментом, β-амилоидом 25–35 (Aβ 25–35). Показано, что введение Aβ 25–35 в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта вызывает распространенные дегенеративные изменения нейронов во фронтальной коре и гиппокампе, подобные тем, которые наблюдаются при деменции Альцгеймеровского типа [32] и проявляются в различных формах когнитивных дефицитов. Электрофизиологическим эквивалентом этих нарушений является вызываемое β-амилоидом 25–35 угнетение длительной гиппокампальной потенциации.

Крысам самцам после предварительной наркотизации (хлоралгидрат, 200 мг/кг, в/б) с помощью стереотаксиса в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта по координатам АР — 1,4; L — 2,7 вводят физиологический раствор или β-амилоид 25–35 в дозе 2 мг/кг (исследуемая группа). После 15-дневного перерыва крысам в течение 7 дней вводят соответственно физиологический раствор или тестируемый препарат. Затем крыс тестируют на различных моделях, позволяющих оценить способность к обучению, память, ориентировочно-исследовательское поведение, уровень тревожности.

4.5.5.4. Модель введения диабетогенного токсина стрептозоцина Сравнительно недавно были разработаны принципиально новые инъекционные мо-

дели БА, основанные на введении диабетогенного токсина стрептозоцина (N-(метил- нитрозокарбомоил)-α-D-глюкозамина).

В литературе описано два типа воздействия стрептозоцина — системное введение и введение в желудочки мозга. В первом случае действие стрептозоцина на клетки мозга не является прямым — токсин не проникает через ГЭБ. Снижение когнитивных способностей, наблюдаемое при системном введении стрептозоцина (200 мг/кг, в/б), может быть опосредованно влиянием на ткань мозга высокого уровня глюкозы, обусловленного деструктивным действием токсина на β-клетки поджелудочной железы.

Более корректную модель БА удалось воссоздать при внутрижелудочковом введении стрептозоцина. В этом случае наблюдается прямое действие препарата на нейроны. Известно, что данное вещество воздействует на клетки, обладающие рецептором к глюкозе Glut-2 и найденные в нейронах крысиного и человеческого мозга. При воздействии на клетку происходит нарушение сигнального пути инсулина и инсулин-подобных факторов роста. Также происходит нарушение метаболизма глюкозы, снижение высвобождения глютамата и развитие оксидативного стресса [33]. Крысам за 7 дней до тестирования поведения и памяти производят двустороннее введение в боковые желудочки мозга стрептозоцина в дозе 3 мг/кг. Введение стрептозоцина проводится на стереотаксическом аппарате после предварительной наркотизации (хлоралгидрат в дозе 200 мг/кг, в/б) по координатам АР –1,5; L –2; H –3,5. НП вводят животным ежедневно в течение 7–14 дней после операции.

5. Анализ механизма действия потенциального ноотропа

При представлении документации по всякому фармакологическому препарату необходимо располагать данными о механизме его действия. В отношении ноотропов данные о механизме действия значительно менее исчерпывающие, чем для других групп нейротропных веществ. Известно, что механизм их действия характеризуется многокомпонентностью.

На уровне общего метаболизма эффект НП характеризуется повышением скорости оборота информационных макромолекул и активацией синтеза фосфолипидов за счет угнетения нуклеотидфосфатазы, активации аденилаткиназы и фосфорилазы А2. Для многих НП показана способность предотвращать активацию перекисного окисления липидов; вызванную такими патологическими процессами, как старение, ишемия, стресс [11].

292

Что касается влияния НП на нейромедиаторные процессы, получены доказательства специфической роли холинергической и глютаматергической систем в реализации эффекта НП. В связи с этим при изучении нового НП может оказаться полезным изучить его влияние на число мускариновых или никотиновых рецепторов и их аффинность к соответствующим лигандам. Доказательства вовлечения глутаматергических механизмов

вреализации эффекта того или иного НП могут быть получены как в исследованиях с изучением влияния данного НП на рецепторное связывание меченого глутамата, так и

вэлектрофизиологических экспериментах. В последнем случае речь может идти как об экспериментах с внутриклеточной регистрацией активности одиночных нейронов и изучением динамики десенситизации при подведении избирательных агонистов различных подтипов NMDA и nonNMDA глютаматергических рецепторов, так и об исследованиях с изучением длительной гиппокампальной потенциации (ДГП). Последняя является глютамат-зависимым электрофизиологическим феноменом синаптической пластичности, имеющей прямое отношение к обучению и памяти. Эффект НП может оцениваться как по облегчению фоновой ДГП, так и по способности восстанавливать дефицит ДГП, обусловленный различными повреждающими воздействиями, например, пренатальной алкоголизацией [28]. Учитывая роль избыточного накопления кальция как патогенетического фактора многих патологических состояний, являющихся объектом применения ноотропов, важную информацию о механизме действия НП можно получить в электрофизиологических экспериментах с регистрацией активности потенциал-зависимых кальциевых каналов изолированных нейронов виноградной улитки [38], при изучении перикисного окисления липидов, изучении глутаматной токсичности и состояния кальциевых каналов, при исследовании противовоспалительного действия вещества.

Представление в Минздравсоцразвития России всего комплекса биохимических и электрофизиологических данных по механизму действия нового НП не является обязательным. Может быть представлен любой фрагмент, касающийся как перечисленных выше механизмов активности, так, особенно для веществ оригинальной структуры, и данные о новых аспектах действия.

6. Изучение спектра нейротропной активности потенциального ноотропа, побочных эффектов и острой токсичности

В связи с тем, что известные НП обладают, помимо основного, ноотропного эффекта, другими проявлениями действия, следует изучить более подробно спектр нейротропной активности нового препарата и получить сведения об его острой токсичности. Следует представить данные о наличии или отсутствии у изучаемого вещества седативного или активирующего, судорожного или противосудорожного, анксиолитического и миорелаксантного действия. Для выявления этих эффектов следует использовать общепринятые тесты: регистрацию поведения в открытом поле и в различных актометрах, тест залезания на сетку, антагонизм с судорожными веществами (коразол, тиосемикарбазид, бикукуллин и др.) и максимальным электрошоком, методики конфликтной ситуации и приподнятого крестообразного лабиринта; для изучения миорелаксантного действия используются тесты вращающегося стержня, рефлекса подтягивания на перекладине, удерживания на перевернутой сетчатой платформе, тест бокового положения. Исследование психотропных эффектов проводится в диапазоне терапевтических доз, оказывающих ноотропный эффект. Изучение побочных эффектов следует осуществлять в более широком диапазоне доз: от средних терапевтических до субтоксических, использовать не менее двух видов животных и путь введения, соответствующий предполагаемому клиническому. Информация о побочных эффектах дополняется результатами, полученными в разделе «Изучение общей фармакологической активности».

Острая токсичность (регистрация гибели животных через 24 ч после введения вещества) изучается на двух видах животных, на которых проводилось исследование ноотропной активности, при тех же путях введения; рассчитывается ЛД50. Данные по по-

293

бочным эффектам, токсичности и терапевтический индекс нового изучаемого препарата сопоставляются с результатами, полученными для эталонных препаратов.

7. Изучение общей фармакологической активности потенциального ноотропа

Наблюдение за состоянием животного осуществляется на мышах и крысах при введении препарата в широком диапазоне доз: от не оказывающих заметного влияния на общее состояние, до вызывающих гибель. При этом определяется повышение или снижение общей возбудимости, увеличение или снижение двигательной активности, наличие тремора, судорожных подергиваний, судорог, гиперкинезов, изменение цвета кожных покровов, взъерошивание шерсти, каталепсия, птоз, стереотипия, груминг и т.д. Изучается пиннеальный, болевой и роговичный рефлексы, влияние на температуру тела, потребление воды и пищи. Следует изучить влияние препарата на эффекты соответствующих нейромедиаторных анализаторов, например, на эффекты ареколина, треморина, 5-окси- триптофана, фенамина, резерпина, дофамина, апоморфина, бикуккулина, флюмазенила, дизоцилпина и других анализаторов.

Влияние на ССС, дыхание и на периферические отделы нервной системы изучается на интактных или наркотизированных кошках, кроликах или крысах по влиянию на уровень кровяного давления, ритм сердечной деятельности (желательно и других показателей работы сердца), дыхание, а также на реакции, вызванные введением нейромедиаторов, например, адреналина, норадреналина, ацетилхолина, серотонина и в ответ на раздражение периферического отрезка блуждающего нерва и др.

Заключение

В заключении резюмируются данные, характеризующие всю совокупность ноотропных свойств представляемого соединения, а также сопутствующих нейротропных эффектов. Описываются выявленное побочное действие. Анализируются основные преимущества нового препарата перед известными средствами сходной направленности действия.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Нестеров В.В. Состояние холинергических структур переднего мозга у бульбэктомированных мышей. Бюлл. эксперим. биол. и медицины, 2001. — Т. 131. — № 5. — С. 507–511.

2.Воронина Т. А. Экспериментальная психофармакология ноотропов. Фармакология ноотропов (ред. Вальдман А. В., Воронина Т. А.). — М.: Медицина, 1989. — С. 91–98.

3.Воронина Т.А. Перспективы применения препаратов с ноотропным, нейропротективным действием. В сб. «Фундаментальные проблемы реаниматологии (Избранные лекции и обзоры)». — Том IV. — М., 2005. — С. 84–113.

4.Воронина Т.А., Гарибова Т. Л., Хромова И.В. Диссоциация антиамнестического и противогипоксического эффектов у ноотропных и противогипоксических препаратов. Фармакол. и токсикол., 1987. — № 3. — С. 21–23.

5.Воронина Т. А. Современные проблемы фармакологии ноотропов, состояние и перспективы. Фармакол. и токсикол., 1991. — № 2. — 6–9.

6.Воронина Т.А., Середенин С.Б., Ноотропные и нейропротекторные средства Экспер и клин. фармакология, 2007. — Т. 70. — №4. — С. 44–58.

7.Гарибова Т.Л., Сопыев Ж. А. Проблемы толерантности и лекарственной зависимости к препаратам с ноотропным типом действия. Фармакология ноотропов (ред. Вальдман А.В., Воронина Т. А.). — М.: Медицина, 1989. — C. 44–53.

294

8.Гарибова Т.Л., Галаева И.П., Воронина Т.А., Крайнева В.А., Капица И.Г., Кириченко С.В., Макаренко А.Н., Мирзоян Г.Р., Кузнецова Е.А. Эффект нооглютила у крыс с интрацеребральной постравматической гематомой (геморрагическим инсультом). — Эксперим. и клин. фармакол., 2003. — Т. 66. — № 2. — C. 45–48.

9.Гарибова Т.Л., Литвинова С.А., Воронина Т.А., Григорьев В.В., Бачурин С.О. Эффект нооглютила на поведение и память мышей линии SAM (Senescence-аccelerated mouse) с генетически детерминированным ускоренным старением. Эксперим. и клин. Фармакол., 2007. — T. 70. — № 4. — С. 3–6.

10.Иноземцев А. Н., Прагина Л. Л., Фирова Ф. А. и др. Сравнительный анализ влияния ноотропных препаратов различной химической структуры на сбой реакции избегания у крыс. Эксперим. и клин. фармакол., 1995. — T. 58. — C. 15–16.

11.Лысенко А.В., Ускова Н.И., Островская Р.У., Гудашева Т.А., Воронина Т.А. Дипептидный ноотроп ГВС-111 предотвращает накопление продуктов перекисного окисления липидов при иммобилизации. Экспер. и клинич. фармакол., 1997. — Т. 60. — № 5. — С. 15–18.

12.Макаренко А.Н., Косицин Н.С., Пасикова Н.В. (2002). Метод моделирования локального кровоизлияния в различных структурах головного мозга у экспериментальных животных. Ж. «Высш. нервн. деят.» — Т. 52. — № 6. — С. 765–768.

13.Назаренко И.В., Каменский А.А., Гудашева Т.А., Волков А.В. Постреанимационное восстановление функций ЦНС при системном введении новых пептидных аналогов пирацетама. Бюлл. эксп. биол. и мед. — 1998. — Т. 123. — № 1. — С. 26–28.

14.Островская Р.У. К механизму антигипоксического эффекта депакина. Бюлл. эксп. биол. мед., 1982. — Т. 93. — № 2. — С. 42–44.

15.Островская Р.У., Клейменова Н.Н., Камышева В.А., Молодавкин Г.М., Яворский А.Н., Бойко С.С. Влияние натрия оксибутирата на функциональные,биохимические и морфологические показатели физической работоспособности. В кн. «Фармакологическая регуляция процессов утомления» — ред. Ю.Г. Бобков. — М., 1982. С. 39–55.

16.Островская Р.У., Гудашева Т.А. Выявление активности ноотропов по показателю острого угашения ориентировочной реакции. Бюлл. эксп. биол. и мед., 1991. — Т. 118. — № 5. — С. 644–647.

17.Островская Р.У., Фирова Ф.А., Трофимов и соавт. Последействие амнестического эффекта скополамина у крыс и его коррекция пирацетамом. Бюлл. эксп. биол. и мед. 1995, Т. 119, № 4, С. 372–374.

18.Поварова О.В., Гарибова Т.Л., Каленикова Е.И., Галаева И.П., Крайнева В.А., Медведев О.С., Воронина Т.А. Влияние фенил-t-бутилнитрона (РВN), мексидола и нооглютила на зону ишемического поражения головного мозга и память у крыс с окклюзией средней мозговой артерии. Экспериментальная и клиническая фармакология., 2004. — Т. 1. — С. 3–6.

19.Романова Г.А. , Трофимов С.С. Ускорение оксибутиратом натрия и пирацетамом компенсатор- но-восстановительных процессов после повреждения коры головного мозга. Бюлл. эксп. биол. и мед., 1986. —Т. 102. — С. 661–663.

20.Романова Г.А. , Барсков И. В. , Островская Р. У., Гудашева Т. А., Викторов И.В. Поведенческие и морфологические нарушения. вызванные двухсторонним фотоиндуцированным тромбозом мозговых сосудов лобной коры мозга крыс. Патофиз. и эксперим. терапия, 1998. — Т. 2. — С. 8–10.

21.Рощина Л.Ф., Островская Р.У. Влияние пирацетама на устойчивость организма к гипоксии. Фармакол. токсикол., 1981. — № 2. — 210–212.

22.Топчан А.В., Мирзоян З.С., Баласанян М.Г. Локальная ишемия мозга крыс, вызванная перевязкой средней мозговой артерии. Эксперим. и клин. фармакол., 1996. — Т. 59. — №5. — С. 62–64.

23.Трофимов С.С., Островская Р.У., Смольникова Н.М. и соавт. Поведенческий и биохимический анализ терапевтического эффекта натрия оксибутирата при алкогольной энцефалопатии у потомства. Фармакол. и токсикол., 1991. — Т. 54. — № 1. — С. 62–64.

24.Трофимов С.С., Островская Р.У., Кравченко Е.В., Смольникова Н.М., Бондаренко Н.А., Кутепова О.А., Немова Е.П., Воронина Т.А. Нарушения поведения крыс, подвергшихся внутриутробной гипоксии, и их коррекция постнатальным воздействием пирацетама. Бюлл. эксп. биол. и мед., 1993. — Т. 113. — № 1. — С. 43–45.

25.Трофимов С.С., Островская Р.У., Смольникова Н.М., Немова Е.П., Воронина Т.А. Значение перинатальной алкоголизации и ее отмены в развитии отдаленных когнитивных нарушений у крыс. Эксперим. и Клин. Фармакол., 1996. — Т. 59. — № 2. — С. 44–46.

26.Чобанов Н.Г., Воронина Т.А., Любимов Б.И. Влияние феназепама и фенобарбитала, вводимых в пренатальном и раннем постнатальном периодах, на поведенческие реакции потомства крыс. Эксперим. и клин. фармакол., 1993. — Т. 56. — № 6. — С. 6–8.

295

ГЛАВА 18

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ АДДИКТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: д. м. н., проф. Э.Э. Звартау; д. м. н. А.Ю. Беспалов; к. б. н. О.А. Драволина; к. м. н. Н.А. Паткина

Введение

Под аддиктивным потенциалом фармакологических средств понимают их способность вызывать патологическое пристрастие. Анализ возможного аддиктивного потенциала является одним из неотъемлемых элементов оценки безопасности новых фармакотерапевтических средств.

Вопросам экспериментального доклинического изучения аддиктивного потенциала фармакологических средств традиционно уделяют много внимания из-за масштабности и тяжести медико-социальных проблем, порождаемых наркотоксиманиями. Однако в последние годы значение своевременного изучения аддиктивного потенциала возросло в связи с бурным развитием нейропсихофармакологии и формированием новых подходов к терапии патологии ЦНС, основанных на фармакогенном влиянии на различные нейротрансмиттерные и нейромодуляторные системы. Новизна фармакотерапевтических подходов определяет непредсказуемость влияния новых препаратов на системы мозга, ответственные за формирование патологического пристрастия, и требует адекватного исследования аддиктивного потенциала.

1.Общие положения

1.1.Понятия и термины

Теоретической основой доклинической оценки аддиктивного потенциала фармакологических средств является физиологическая концепция патогенеза наркотоксикоманий, согласно которой нейробиологическая природа аддиктивного эффекта фармакологических средств связана с их влиянием на мозговые системы «награды» и «наказания» [1]. Физиологической основой аддиктивного потенциала фармакологического агента является наличие у него подкрепляющих свойств. Под подкреплением понимают процесс, при котором вероятность той или иной поведенческой реакции (например, поведение поиска наркотика) увеличивается благодаря следующим за ней событиям. Стимул (в том числе фармакологическое вещество), который увеличивает вероятность поведения, после которого он следует, называется подкрепляющим стимулом. Предъявление положительноподкрепляющих стимулов увеличивает вероятность поведения, за которым они следуют. Вероятность конкретной поведенческой реакции также увеличивается, если она ведет к устранению или предупреждению отрицательно-подкрепляющих стимулов. Фармакологические вещества могут обладать как положительно, так и отрицательно подкрепляющими свойствами. В последнем случае речь идет о веществах, способных вызывать зависимость, прекращение введения которых выражается в синдроме отмены. Аверсивные свойства синдрома отмены лучше всего купируются введением самого вещества. Тем не менее, хотя развитие как физической зависимости, так и толерантности присутствует в

297

диагностических критериях лекарственной зависимости, выраженность аддиктивного потенциала определяется прежде всего положительно-подкрепляющими свойствами, выявлению которых и посвящены настоящие методические рекомендации.

1.2. Рекомендуемые тесты

На основе экспериментальных исследований выявляют фармакологические свойства веществ, рассматриваемые как специфические предикторы способности психоактивных соединений вызывать пристрастие:

1.Наличие у вещества первично-подкрепляющих свойств. Эти свойства выявляются

висследованиях по выработке и поддержанию поведенческой реакции внутривенного самовведения (РВС), при которой безусловным подкрепляющим раздражителем является исследуемое вещество [2, 10].

2.Наличие у вещества дифференцировочных интероцептивных стимульных свойств, сходных с таковыми известных веществ с высоким аддиктивным потенциалом. Эти свойства выявляются в исследованиях по лекарственной дифференцировке [2, 8].

3.Наличие у вещества способности вызывать активацию системы положительного подкрепления (системы «награды») [6]. Данное свойство выявляют по изменению показателей реакции электрической самостимуляции (РСС) мозга [4, 7, 9,].

1.3. Цели и задачи исследования. Основные этапы исследования

Целью исследования является прогнозирование потенциала пристрастия (аддиктивный потенциал) данного соединения. Задачами исследования являются: а) выявление вышеуказанных специфических предикторов; б) сопоставление активности и эффективности главного (терапевтического) эффекта исследуемого вещества с его активностью и эффективностью в тестах оценки аддиктивного потенциала; в) заключение о наркологической безопасности фармакологического средства.

Заключение об аддиктивном потенциале и степени наркологической безопасности фармакологического средства может быть дано на основе комплексного исследования с использованием ряда предлагаемых экспериментальных тестов и с учетом всей имеющейся дополнительной информации, определяющей аддиктивный потенциал фармакологического вещества.

1.4. Условия проведения исследования

Исследования должны проводиться в стандартных, контролируемых лабораторных условиях с соблюдением всех требований нормативных документов, регламентирующих такой тип работ, включая правила содержания и использования лабораторных животных.

1.5. Характеристика фармакологического вещества

Адекватное планирование исследований требует наличия, как минимум, следующей информации: а) рецепторные системы, с которыми взаимодействует данное вещество; б) фармакокинетические свойства (период полувыведения, проникновение через гематоэнцефалический барьер, биодоступность при основных путях введения); в) предполагаемое терапевтическое применение. Планированию экспериментов также способствует знание эффектов вещества, которые были зафиксированы в предыдущих исследованиях (например, информация о влиянии на различные нейрохимические системы, наличие психотропной активности).

1.6. Растворители и разбавители

Инструментальное поведение, лежащее в основе методов оценки аддиктивного потенциала, требует использования максимально инертных растворителей, не обладающих местным раздражающим или системным угнетающим действием. При исследовании

298

водонерастворимых веществ с помощью метода лекарственной дифференцировки или реакции самостимуляции допустимо использование липидных взвесей и суспензий (например, на основе 1% водного раствора Твин 80), что, однако, требует забора образцов крови для проведения анализа достигнутой концентрации вещества в крови и сравнения ее с уровнем, необходимым для проявления терапевтических эффектов. Нерастворимость вещества ограничивает возможность использования метода внутривенного самовведения, который в таком случае может быть заменен на исследование действия вещества на реакцию самостимуляции.

1.7. Дозы, пути и режимы введения

Каждое вещество должно быть исследовано в диапазоне доз, достаточном для обоснованного заключения о наличии или отсутствии у него аддиктивного потенциала. Нижняя граница диапазона исследуемых доз определяется двумя факторами: а) соотношением сродства вещества к рецептору-мишени и достигаемой концентрацией свободного (не связанного с белками) вещества во внеклеточном пространстве; б) типом взаимодействия вещества и рецептора-мишени. Для веществ-агонистов исследуемый диапазон доз обычно значительно шире, чем для антагонистов. Верхняя граница диапазона доз определяется по достижению уровня, при котором вещество начинает вызывать неспецифические изменения в поведении (например, снижение частоты оперантной реакции при лекарственной дифференцировке). Для реакции самовведения диапазон исследуемых доз определяется периодом полувыведения вещества и размером разовой дозы (т.е. дозой, соответствующей единичной инъекции).

Для методов лекарственной дифференцировки или реакции самостимуляции допустимы практически любые пути и режимы введения. Для реакции самовведения наиболее предпочтительным является внутривенный путь введения.

1.8. Продолжительность исследования

Исследования с использованием методов лекарственной дифференцировки или реакции самостимуляции подразумевают однократные введения исследуемых веществ. Однако ввиду того, что различные дозы веществ исследуют с помощью одних и тех же животных, а также необходимости ограничивать частоту повторных тестирований, длительность таких экспериментов достигает 4–6 недель. Для реакции внутривенного самовведения у мышей длительность эксперимента не превышает 1 неделю, в то время как исследование реакции самовведения у крыс требует не менее 3 месяцев.

1.9. Экспериментальные животные

Рекомендуемые исследования могут быть выполнены как на мышах, так и на крысах. Наличие дополнительной информации об исследуемом веществе может помочь в выборе вида, линии и пола животных (например, отсутствие рецептора-мишени у мышей или наличие дополнительных изоформ рецепторов-мишеней у крыс).

1.10. Рекомендации по выбору препарата сравнения

Выбор препаратов сравнения является важным этапом построения исследовательской программы для прогнозирования аддиктивного потенциала нового ЛС. Традиционно выделяют несколько основных типов аддиктивных средств (психостимуляторы, опиаты, седативные и снотворные, галлюциногены и т.д.). Наиболее информативной является близость исследуемого вещества к одному или более классам известных аддиктивных средств (химическая структура, общие рецепторы-посредники, активация одних и тех же нейроанатомических структур и проекций, одинаковые нейрохимические изменения, схожие фармакологические эффекты на системном уровне). В отсутствие данной информации за основу может быть взята область предполагаемого терапевтического применения вещества (например, для новых аналгетиков препаратами сравнения могут быть опиаты).

299

2. Инициация внутривенного самовведения у мышей

2.1. Цели и задачи эксперимента

Цель эксперимента — получение в режиме экспресс-тестирования данных о первичноподкрепляющих свойствах исследуемого вещества. Задачами эксперимента являются доказательство инициации РВС исследуемого вещества, выявление зависимости «разовая доза–эффект», определение параметров активности и эффективности подкрепляющего эффекта в сравнении с эталонным аддиктивным веществом.

Главное достоинство метода — быстрота получения результатов, что обусловлено использованием естественной ориентировочно-исследовательской реакции мышей (выглядывание в отверстие при помещении в затененную камеру), способствующей выработке оперантной реакции. При сочетании с инфузией раствора аддиктивного соединения исследовательская реакция не угашается, а, напротив, оживляется, так как исследуемый препарат обладает «аттрактивными» мотивационными свойствами.

2.2. Оборудование, инструменты и реактивы

Экспериментальные животные: мыши-самцы массой 18–24 г. Экспериментальная установка должна обеспечивать возможность размещения двух мышей в смежных камерах, размеры которых (например, 8 × 8 × 8 см) позволяют животным сохранять относительную свободу движений, в частности, совершать выглядывания в отверстие передней стенки камеры, несмотря на фиксацию хвоста. Отверстие диаметром 1,4 см расположено на высоте 1,4 см от пола и снабжено инфракрасным датчиком для регистрации реакции выглядывания. Фотодатчик через интерфейс связан с компьютером, который управляет работой двухшприцевого микроинъектора с шаговыми двигателями, осуществляя кратковременную инъекцию заданного объема раствора исследуемого препарата (1,6 мкл/ инъекцию) в ответ на каждое выглядывание. Задняя стенка каждого бокса прорезана вертикальной щелью шириной 0,5 см. Размещение животного в боксе производят с учетом следующих требований: 1) мышь должна свободно выглядывать в отверстие на передней стенке; 2) обеспечен доступ для пункции к латеральным хвостовым венам (хвост выводят через щель на задней стенке за пределы бокса и фиксируют к горизонтальной поверхности липкой лентой); 3) исключена возможность выдергивания иглы и повреждения катетера животным во время эксперимента. По данным литературы и собственному опыту мыши сравнительно легко переносят данную форму частичной иммобилизации.

2.3. Описание метода

Протокол исследования включает исходное тестирование ориентировочно-исследо- вательской активности и последующую сессию инициации (выработки) РВС. Задачей исходного 10-минутного тестирования являются оценка индивидуальной ориентировочноисследовательской реакции мышей и последующий подбор по уровню активности пар животных (уровень активности в паре должен быть по возможности близким) для сессии инициации РВС.

Как показывает опыт, выработка РВС эталонных аддиктивных веществ (морфин, кокаин, амфетамин) происходит в течение 10–20 мин, поэтому общая продолжительность сессии инициации РВС исследуемых веществ составляет 30 мин. Предварительно отобранные пары мышей помещают в экспериментальные боксы и после кратковременной адаптации в латеральные хвостовые вены обеих мышей вводят иглы, подсоединенные к инъектору через полиэтиленовые катетеры. Во время сессии выработки РВС «активная» мышь (АМ) получает инъекции исследуемого раствора после каждого выглядывания. «Контрольная» мышь (КМ) получает инъекции в ритме выглядываний АМ, вне связи с собственными выглядываниями. Таким образом, обе мыши получают одинаковое число инъекций с одинаковым распределением во времени и, соответственно, одинаковую дозу препарата, что позволяет при оценке эффекта и сравнении данных у АМ и КМ «урав-

300