3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

Для вычленения тех или иных ионных токов используют различные по композиции растворы, заполняющие patch-пипетку, и различный поддерживаемый потенциал. Например, если задача эксперимента включает в себя регистрацию только пика кальциевого тока, раствор должен включать в себя 140 мМ CsCl, 5,5 мМ MgCl2, 5 мМ Na2ATP, 0,01 мМ EGTA, 10 HEPES/KOH (pH 7,2). В этом случае Cs+ выступает как блокатор K+-тока. Для полного ингибирования Na+-тока можно добавить необходимое количество блокаторов Na+-каналов, хотя обычно правильно подобранная величина поддерживаемого потенциала (holding potential) ингибирует Na+-ток. Разумеется, что во внеклеточном растворе 5,4 мМ KCl надо также заменить на 5,4 мМ CsCl.

Сначала patch-пипетку подводят вплотную к мембране изолированной клетки и создают в ней небольшое отрицательное давление. Это приводит к тому, что мембрана плотно закупоривает отверстие пипетки и формируется высокоомный контакт — конфигурация cell-attached, или, иначе, переход пипетка — мембрана с сопротивлением утечки более 1 ГОм (так называемый giga seal). После нормализации давления в пипетке конфигурация cell-attached близка к физиологической ситуации, поскольку зона мембраны, захваченная пипеткой, с внутренней стороны контактирует с внутриклеточной жидкостью,

ас внешней стороны — со стандартным внеклеточным раствором, которым заполняют patch-пипетку. Эта конфигурация, с одной стороны, позволяет регистрировать одиночные ионные каналы под пипеткой, а с другой, является промежуточной для других конфигураций. Конфигурация позволяет изучать на одиночном канале роль соединений, которые активируют или инактивируют каналы снаружи.

Конфигурация cell-attached позволяет сформировать другую конфигурацию, называемую inside-out patch. К ее образованию приводит резкое отрывание пипетки от клетки, причем giga seal не меняется. В этом случае на пипетке находится лишь фрагмент мембраны (patch), внутренняя сторона которой смотрит в омывающий раствор перфузионной камеры, а внешняя контактирует с содержимым пипетки. Данная конфигурация используется для изучения вклада соединений цитоплазмы в канальную активность.

Конфигурация cell-attached позволяет двумя путями (в зависимости от задач исследователя) сформировать конфигурацию, называемую whole-cell. В одном случае для ее получения в пипетку необходимо резко и одномоментно подать небольшое отрицательное давление, разрывающее мембрану под пипеткой и образующее низкоомный путь между внутренней средой клетки и раствором в пипетке. При этом в мембране возникает дырка, величина которой позволяет осуществлять обмен ионов и различных соединений между пипеткой и цитоплазмой. В другом случае низкоомный путь между внутренней средой клетки и раствором в пипетке формируется за счет влияния соединений, находящихся в пипетке и вызывающих образование в мембране пор, проницаемых для ионов, но не для молекул. Это перфоративный (perforated) patch. Антибиотики нистатин (nystatin) и амфотерицин-Б (amphotericin-B) используют в пипеточном растворе, чтобы образовать специфические поры на участке мембраны под пипеткой. Они пропускают через мембрану моновалентные катионы и анионы. Еще одно соединение — грамицидин (gramicidin) — помогает формировать каналы, проницаемые только для моновалентных катионов. Эта методика позволяет исследовать ионные токи, протекающие через мембрану, идентифицировать и вычленить их.

Конфигурация whole-cell позволяет сформировать другую конфигурацию — outsideout patch. Медленное оттягивание пипетки от клетки заставляет мембрану растягиваться до тех пор, пока она не отделится от клетки и не сошьется. Теперь ее внутренняя часть будет контактировать с раствором в пипетке, а внешняя — с омывающим раствором в перфузионной камере. Эта конфигурация используется для изучения вклада соединений внешней среды клетки в активность единичных каналов.

Далее о токах, текущих через мембрану целой клетки или одиночный ионный канал, представляют в виде вольт-амперной характеристики клетки. Для этого с шагом в 10 мВ,

апри приближении к точке пересечения оси абсцисс с осью ординат (то есть к нулевой

401

точке потенциала и тока) с шагом в 5 мВ от величины holding potential, должны быть поданы тестирующие импульсы отрицательной полярности до -100 мВ, после чего тестирующие импульсы положительной полярности до величины +100 мВ.

Важно определение емкости клетки. Для этого от уровня в -80 мВ (или несколько большего) на клетку подают тестирующий импульс отрицательной полярности величиной не более 10 мВ (на самом деле точная величина тестирующего импульса не так важна, хотя обычно на клетку подают действительно 10 мВ. Важно чтобы не активировался ни один ток) и регистрируют площадь емкостных пиков, соответствующих фронту нарастания сигнала (в положительную область) и фронту падения сигнала (в отрицательную область), вычисляя на этой основе емкость клетки. В этом случае используется простой расчет, связанный с RC-цепочкой. Если подать достаточно длинный импульс, то площадь под емкостным артефактом равна RC при соблюдении двух приближений. Необходимо пренебречь фронтом нарастания и считать спад как моноэкспоненциальный. Если импульс длинный, то ток в конце импульса дает величину R=U/I и соответственно можно подсчитать С. Емкость клетки необходима для нормирования величины тока, то есть для получения значений pA/pF. Такое нормирование крайне необходимо, поскольку величина тока зависит от размеров клетки, определение которых практически невозможно. Другими словами, у разных по размеру клеток будут регистрироваться разные по величине токи, поэтому проведение статистического анализа практически невозможно. Однако поскольку размеры клетки напрямую связаны с ее емкостью, принято осуществлять нормирование по величине емкости.

По завершении этих исследований определяют особенности электрофизиологического действия и тропность изучаемых соединений к потенциалуправляемым ионным каналам и, следовательно, принадлежность к тому или иному классу антиаритмических препаратов.

Физиология и молекулярная биология мембран клеток, микроэлектродные методы и их техническое обеспечение подробно описаны в работах [6, 7].

3.1.3. Электрофизиологический метод исследования механизма действия отобранных соединений в экспериментах in vivo

Исследование влияния изучаемых соединений на проводящую систему сердца при помощи программной электрической стимуляции миокарда проводится на наркотизированных (пентобарбитал 40 мг/кг внутривенно) беспородных собаках обоего пола массой 10–15 кг. Собак наркотизируют до IIIа уровня хирургического наркоза, после чего интубируют и переводят на искусственное дыхание кислородно-воздушной смесью в соотношении 1:1 (возможна вентиляция комнатным воздухом). Животных фиксируют на операционном столе в положении на правом боку. После торако- (по 3–4-му межреберью) и перикардотомии биполярный электрод (расстояние между полюсами электрода 5 мм) фиксируется на левом ушке сердца. При помощи этого электрода проводят электрическую стимуляцию и регистрацию электрограммы левого желудочка. Вторую пару электродов вводят в толщу миокарда левого желудочка в области, прилежащей к левому предсердию. С его помощью проводят стимуляцию и регистрируют электрограмму левого желудочка. Третий биполярный зонд проводят через левую бедренную артерию и устанавливают в начальной части аорты для регистрации электрограммы пучка Гиса. Параллельно регистрируют ЭКГ во II стандартном отведении. Оценивают следующие показатели:

—интервал РР;

—интервал PQ;

—длительность комплекса QRS;

—интервал QT.

Измерения производят на синусовом ритме, величину интервала QT выражают в абсолютных величинах в мс, обозначая данный показатель QTmax. Величину интервала QT выражают также в корригированной форме (QTс), определяя ее по формуле:

402

Длительность интервала QT измеряют также при частой стимуляции предсердий в последнем навязанном цикле, определяя наименьшую его величину во всем диапазоне частот стимуляции. Этот показатель обозначают как QTmin;

—интервал РA (время внутрисердечного проведения) — время от начала зубца Р в любом из трех стандартных отведений наружной ЭКГ до первой быстрой высокоамплитудной осцилляции предсердий на электрограмме пучка Гиса;

—интервал AН (время проведения импульсов по атриовентрикулярному узлу) — время от начала первой быстрой высокоамплитудной осцилляции предсердий на электрограмме пучка Гиса до начала осцилляции пучка Гиса;

—интервал HV (время проведения импульсов по системе Гиса-Пуркинье) — время от начала осцилляции пучка Гиса до начала возбуждения желудочков по электрограмме пучка Гиса или наружной ЭКГ в зависимости от того, где возбуждение желудочков регистрируется раньше;

—минимальная длительность цикла стимуляции предсердия, при которой сохраняется проведение импульсов на желудочки с кратностью 1:1 (CL 1:1);

—время восстановления функции синусового узла (SNRT) — время от начала последней активации предсердий, вызванной электростимулом, до начала первой спонтанной активации предсердий после прекращения серии частой стимуляции предсердий. Данную величину определяют на всех частотах стимуляции предсердий и в качестве SNRT выбирают максимальную из них. Вычитая из полученной величины SNRT длительность спонтанного синусового цикла (интервал РР), получают корригированное время восстановления функций синусового узла (СSNRT);

—эффективный рефрактерный период предсердий (ERPA);

—функциональный рефрактерный период предсердий (FRPA);

—общий рефрактерный период предсердий (TRPA);

—относительный рефрактерный период предсердий (RRPA) — разность между TRPA и ERPA;

—эффективный рефрактерный период атриовентрикулярного узла (ERPAVN);

—функциональный рефрактерный период атриовентрикулярного узла (FRPAVN);

—общий рефрактерный период системы Гиса-Пуркинье (TRPHPS);

—эффективный рефрактерный период желудочков (ERPV);

—функциональный рефрактерный период желудочков (FRPV).

При электростимцуляции желудочков различают следующие виды спонтанной эктопической активности:

—повторный желудочковый ответ (RR) — от 1 до 5 следующих друг за другом спонтанных эктопических возбуждений желудочков;

—неустойчивая желудочковая тахикардия (VTNS) — спонтанная желудочковая эктопическая активность продолжительностью более 5 циклов, но менее 30 с;

—устойчивая желудочковая тахикардия (VTS) — спонтанная желудочковая эктопическая активность продолжительностью более 30 с;

—фибрилляция желудочков (VFb).

При развитии VFb или VTS, не купирующейся электростимуляцией желудочков и приводящей к серьезным гемодинамическим последствиям, проводят электроимпульсную терапию (DS shock). При этом энергию импульса подбирают, начиная с 1,0 кВ, так, чтобы определить порог дефибрилляции. Если это происходит в контрольном исследовании до введения препарата, то после восстановления нормального ритма следует выждать период не менее 20 мин, контролируя величину ERPV и давая ей возможность вернуться к контрольному значению.

403

После завершения контрольного исследования вводят изучаемый препарат. В течение 60 мин через каждые 5 мин измеряют интервалы ЭКГ и электрограммы пучка Гиса. Начиная с 15 мин, проводят программу электростимуляции в последовательности, описанной выше. В случае, когда у одного животного изучают препарат в двух разных дозах, вторую дозу следует вводить не менее чем через час после введения первой. Контрольными значениями изучаемых показателей для второй дозы служат те же величины, что

идля первой.

3.2.Исследование механизма действия соединений, проявивших высокую активность при нарушениях сердечного ритма центрального генеза

3.2.1.Исследование влияния изучаемых соединений на трансмембранные ионные токи — кальциевые, натриевые и медленные калиевые

Исследования проводят на изолированных нейронах брюхоногого моллюска — прудовика большого (Lymnaea stagnalis) по методу [4]. При этом используют неидентифицированные нейроны. Из тела моллюска выделяют окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое затем обрабатывают 0,25 % раствором трипсина в течение 40–60 мин. Ферментативная обработка позволяет освободить поверхность мембраны нейронов от соединительнотканных оболочек, глиальных клеток и других диффузионных барьеров. После обработки трипсином ганглии помещают в раствор «Рингер К» и через 5–10 мин подвергают механическому разделению под бинокулярным микроскопом с помощью вольфрамовых игл и полиэтиленовой пипетки. Полученные таким образом нейроны жизнеспособны и сохраняют свои электрические характеристики в течение 1–3 суток.

Используют растворы со следующим ионным составом: 1. Наружные (перфузирующие) растворы (в мМ):

а) для регистрации суммарного входящего тока («Рингер К»): NaCl — 100; KCl — 5; CaCl2 — 2; MgCl2 - 1,5; Tris-OH — 2; рН = 7,5;

б) для регистрации кальциевого тока: СаСl2 — 10; MgCl2 — 5; CsCl — 100; Tris-OH — 2; рН = 7,5.

в) для регистрации натриевого тока: NaCl — 110; MgCl2 — 1,5; Tris-OH — 2; рН = 7,5. 2. Внутриклеточные (диализирующие) растворы (в мМ):

а) для регистрации суммарного выходящего калиевого тока: KCl — 120; Tris-OH — 2; рН = 7,4;

б) для регистрации кальциевого или натриевого токов: CsCl — 120; Tris-OH — 2; рН = 7,4. Перфузирующий раствор подают в камеру, где находится нейрон на полиэтиленовой микропипетке, а диализирующий раствор — внутри этой пипетки. Исследуемые веще-

ства добавляют в перфузирующий (наружный) раствор.

Для измерения трансмембранных ионных токов применяют метод внутриклеточной перфузии изолированных нейронов и фиксации мембранного потенциала. В состав установки для измерения трансмембранных ионных токов входят следующие блоки: камера (полиэтиленовая пипетка, нейрон, кювета с наружным раствором, электроды); усилители для фиксации потенциала; осциллограф; программируемый генератор импульсов ПГИ-100; блок питания усилителей для фиксации потенциала; компьютер; принтер.

Для изготовления микропипетки с «порой» используют тонкую полиэтиленовую трубку длиной 3 см, согнутую V-образно в струе горячего воздуха, и на ее сгибе тонкой стальной проволокой формируют выступ. Затем на вершине выступа под бинокулярной лупой иглой делают отверстие. Изготовленную микропипетку соединяют с системой трубочек для подачи диализирующего раствора. По величине электрического сопротивления (порядка 200–400 кОм) оценивают диаметр отверстия (3–5 мкм), т. е. пригодность микропипетки для дальнейшей работы.

С раствором в полиэтиленовой микропипетке должен контактировать агаровый мостик с неполяризующимся хлор-серебряным электродом, через который с помощью

404

усилителей поддерживается фиксированный потенциал. Второй такой же электрод помещают в камеру и используют для регистрации ионных токов с помощью усилителяпреобразователя «ток-напряжение».

Кривые ионных токов визуально оценивают на экране осциллографа, вводят в компьютер и распечатывают на принтере.

Эксперименты и обработку результатов проводят следующим образом. Изолированную живую клетку помещают на полиэтиленовую пипетку при фиксиро-

ванном потенциале –80 мВ. В микропипетке создаются толчки отрицательного гидростатического давления. Вследствие этого в области «поры» пипетки мембрана находящегося в ней нейрона разрушается и создается электрический контакт неполяризующегося электрода (соединенного с усилителем фиксации потенциала) с внутриклеточным содержимым. При гиперполяризующем сдвиге мембранного потенциала на экране осциллографа регистрируются параметры емкостных токов мембраны и неспецифического тока утечки, который «вычитают» из величины общего тока. После переключения тестирующего импульса на «деполяризацию» регистрируют входящий (натрий-кальциевый) и выходящий (быстрый и медленный калиевый) ток.

Вслед за регистрацией суммарных ионных токов производят замену внутриклеточного и наружного растворов на растворы, необходимые для регистрации отдельного тока. Выделение чистых кальциевых или натриевых токов со стабильными их параметрами, которые принимаются за исходные значения (до начала действия исследуемого вещества), происходит через 3–5 мин после полной замены растворов. Затем раствор в камере, где находился нейрон, заменяют на раствор с исследуемым веществом. Когда изменения ионных токов, вызванные влиянием этого вещества, стабилизировались (через 2–3 мин), вновь регистрируют величины токов (в период действия вещества). Затем раствор заменяют на раствор с большей концентрацией и в конце эксперимента — на раствор с исходной концентрацией и наблюдают динамику восстановления ионных токов.

Исследуемые соединения в избранных концентрациях (мкМ) добавляют в наружные растворы для выделения соответствующих токов и их оценки.

На основании полученных данных с помощью компьютера анализируются вольтамперные характеристики и их корреляции в системе «концентрация-эффект». Исходные величины токов принимают за 100%, а установившиеся при действии исследуемых веществ величины токов сопоставляют (в процентах) с исходными. Во внимание принимают различия, соответствующие t-критерию Стьюдента.

3.2.2. Исследование влияния изучаемых соединений на ионный гомеостаз в кардиомицитах крыс

К основным причинам развития аритмий относится ишемия миокарда. Индуцируемые гипоксией сдвиги внутриклеточного энергетического метаболизма вызывают изменения трансмембранных ионных потоков Na+, K+, Са2+, приводящие к различным нарушениям автоматизма и проводимости кардиальных клеток. К числу важных аритмогенных факторов относятся: повышение диастолической концентрации свободных ионов натрия и кальция в цитоплазме кардиомиоцитов, снижение потенциала покоя плазматической мембраны клеток. В основе молекулярного механизма действия антиаритмических препаратов лежит специфическое ингибирование активности ионных каналов для Na+, K+, Са2+, блокада b1-адренорецепторов сердца. Молекулярными мишенями действия антиаритмиков являются ионные каналы, переносчики и адренорецепторы наружной плазматической мембраны кардиомиоцитов. На основе механизма их действия антиаритмические препараты классифицированы E.M. Vaughan Williams на I–V классы.

В связи с этим новые соединения с антиаритмической активностью важно исследовать в плане влияния их на ионный гомеостаз покоящихся и стимулированных кардио-

405

миоцитов крыс. В качестве референтных препаратов могут быть использованы антиаритмики различных классов (согласно классификации E.M. Vaughan Williams).

В работе используют следующие реактивы: CdCl2, NiCl2; HEPES, NaCl, KCl, CaCl2, NaH2PO4, MgSO4, ЭГТА, тапсигаргин; Fura-2/AM; MnCl2, дигитонин, изопротеронол, кофеин, адреналин; HCl, NaOH. Все растворы готовят на дистиллированной воде.

Определение ионов кальция [Ca++]цит в кардиомиоцитах осуществляют с помощью флуоресцентного зонда — тетраацетоксиметилового эфира (Fura-2/AM).

Внутриклеточную концентрацию кальция рассчитывают на основании измерений при двух длинах волн возбуждения (F340 и F380), используя следующий прием. В общем виде значения интенсивностей, соответствующие этим двум длинам волн, выражают следующим образом:

F340 = SFf340 × cf + Sb380 × cb; F380 = S Ff380 × cf + Sb380 × cb,

где cf и cb – концентрации свободного индикатора и его комплекса с кальцием соответственно, а S – фактор, зависящий от коэффициента поглощения, интенсивности возбуждающего света, длины оптического пути в кювете, квантового выхода.

Затем, вводя параметр R = Ff340/ Ff380 и применив уравнение закона действующих масс для реакций первого порядка cb = cf × [Ca++]цит/Кd, переходят к выражению:

(Sf340 + Sb340× [Ca++]цит/Кd) × (Sf380 + Sb380× [Ca++]цит/Кd) = R. Решив это уравнение относительно R, получают

[Ca++]цит = Kd (R — Rmin)/(Rmax – R)/ (Sf380/Sb380),

где Rmin = R при cb = 0, т. е. Rmin = Sf340/Sf380, Rmax = R при cf = 0, т. е. Rmax = Sb340/Sb380. Конечная формула принимает вид:

[Ca++]цит = Kd × k × (R — Rmin)/(Rmax – R).

R – регистрируемый уровень флуоресценции. Значение Кдисс — равновесной константы диссоциации Fura-2/AM с Са++ — определяют в модельных исследованиях, используя раствор Fura-2.

Определение внутриклеточной концентрации ионов натрия в кардиомиоцитах с помощью флуоресцентного зонда SBFI проводят по методу, описанному A.I. Khankoeva et al. (1997). Концентрацию ионов натрия в саркоплазме рассчитывают по формуле:

[Na+]цит = Kd × k × (R — Rmin)/(Rmax — R),

где R — отношение флуоресценции при длинах возбуждающего света 340 нм (F340) и 380 нм (F380); R min и Rmax — то же при нулевой и насыщающей концентрации [Na+] цит (150 mM); k — отношение интенсивности флуоресценции при 380 нм для свободного и связанного зонда (2,1 ± 0,1); Kd — равновесная константа диссоциации комплекса зонд– Na, равная 20,8 ± 1,4 мМ.

Оценку изменений внутриклеточной концентрации ионов калия в кардиомиоцитах с помощью флуоресцентного зонда PBFI проводят по методике, описанной Ru-Chi Shieh et al. (1994).

Для моделирования условий гипоксии клетки инкубируют в течение 30 мин при 37 °С в среде, содержащей 0,5 мМ KCN и 10 мМ 2-дезоксиглюкозу.

Электрическую стимуляцию кардиомиоцитов осуществляют с помощью установки MacLab system (Австралия) или ее аналогов. Стимуляцию β1-адренорецепторов карди-

406

омиоцитов проводят путем добавления к клеточной суспензии 30 нМ изопротеренола. Для определения содержания цАМФ в кардиомиоцитах используют стандартные наборы фирмы «Amersham» или их аналоги.

Расчет доверительных интервалов экспериментальных значений и оценку достоверности различий между ними проводят с помощью параметрического t-критерия Стьюдента при уровне значимости, равном 0,05.

3.2.3. Исследование влияния изучаемых соединений на функциональную активность различных типов рецепторов

основных нейромедиаторов ЦНС на модели изолированных мембран синаптосом продолговатого мозга крыс

Нормализующее влияние на нарушенный ритм сердечных сокращений могут оказывать вещества, относящиеся к разным классам химических соединений и принадлежащие к различным фармакологическим группам. Антиаритмический эффект могут оказывать успокаивающие (седативные, транквилизирующие) препараты, многие нейротропные средства (холиноблокаторы и холиномиметики, адреноблокаторы и адреномиметики, местные анестетики, некоторые антиконвульсанты с противоэпилептической активностью), препараты, содержащие соли калия, антагонисты ионов кальция и др.

Исходя из вышеизложенного представляется важным исследовать влияние нового вещества (в случае наличия у него нейротропных свойств) на основные рецепторные системы, принимающие участие в центральных механизмах регуляции сердечного ритма. К ним относятся рецепторы глутамата (NMDA и метаботропные рецепторы), рецепторы серотонина различных подтипов (5-HT1, 5-НТ2 и 5-HT3) [30, 34]. В качестве препаратов сравнения могут быть избраны различные антиаритмики, относящиеся к различным классам по классификации E.M. Vaughan Williams. Исследуемое вещество может быть изучено в плане влияния его на функциональную активность двух различных семейств рецепторных систем, отличающихся по механизмам передачи внеклеточного сигнала с плазматической мембраны нейронов, и формирования клеточного ответа, а именно рецепторов, сопряженных с ионными каналами и синтезом циклических нуклеотидов.

Активацию мембранных рецепторов нейромедиаторов ЦНС, встроенных в плазматические мембраны нейронов, которые одновременно являются ионными каналами, можно оценить по изменению содержания ионов кальция, натрия, хлора в синаптосомальных везикулах, образованных плазматическими мембранами. В частности, к ним относятся 5-HT3-тип рецепторов серотонина, ГАМКA-тип рецепторов ГАМК и NMDA-тип рецепторов глутамата.

Согласно данным Y. Pankratov et al. [35] функциональная активность 5-HT3-типа рецепторов серотонина опосредована открытием кальциевого канала и последующим повышением внутриклеточного/синаптосомального уровня свободных ионов кальция ([Са2+]вн). Активность ГАМКA-типа рецепторов ГАМК определяется током ионов хлора через ионофор, входящий в состав ГАМК-бензодиазепинового комплекса [33]. Активация NMDA-типа рецепторов глутамата сопровождается открытием катионового канала и поступлением ионов кальция и натрия из внеклеточного пространства в синаптосомы [28].

Функциональную активность другого семейства мембранных рецепторов нейромедиаторов ЦНС, представленного рецепторами, локализованными в плазматических мембранах нейронов и сопряженными с активацией G-белков, можно оценить, регистрируя изменения концентрации в синаптосомах вторичных мессенджеров — циклического аденозинмонофосфата и инозитол-трифосфата. Активация 5-HT1-типа рецепторов серотонина сопровождается ингибированием активности аденилатциклазы и последующим снижением внутриклеточной/синаптосомальной концентрации вторичного мессенджера цАМФ. В то же время активация метаботропных рецепторов глутамата и 5-HT2-типа рецепторов серотонина приводит к увеличению внутриклеточного/синаптосомального содержания вторичного мессенджера инозитол-трифосфата [16]. Стимуляция β-адрено-

407

рецепторов вызывает повышение внутриклеточной/синаптосомальной концентрации вторичного мессенджера цАМФ [17].

Синаптосомы — везикулы плазматических мембран — из вентролатеральных отделов продолговатого мозга получают с помощью метода дифференциального центрифугирования в градиенте перколла [18]. Для оценки изменений внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция и натрия используют специфические флуоресцентные индикаторы Fluo-3 и SBFI. Процедуры нагружения синаптосом флуоресцентными зондами, расчет концентрации ионов в везикулах проводят по методикам, описанным в работах [21]. Конечная концентрация зондов во внутривезикулярной среде желательна в пределах 5–7 мкМ. Концентрацию везикулярного ионизированного кальция ([Са2+]вн) рассчитывают по формуле [31]:

[Са2+ ]вн = Кd ( Fmax — F530 )/( F530 — Fmin ),

где F530 — интенсивность флуоресценции образца при 530 нм; Fmax – флуоресценция в условиях насыщения зонда кальцием, определяемая после внесения 30 мкМ дигитонина и 1мМ СaCl2; Fmin — интенсивность флуоресценции при нулевой (в присутствии 5 мМ ЭГТА и 5 мкМ А23187) концентрации кальция; Кd — равновесная константа диссоциации комплекса Fluo-Ca, равная 0,42 мкМ.

Перед измерением включения Са2+ пробы преинкубируют при 37 °С в течение 30 мин — времени, достаточном для достижения равновесия в системе среда — везикулы. Для вычисления количества Са2+, накопленного в везикулах, в предварительных экспериментах определяют внутривезикулярный объем.

Для перерасчета интенсивности флуоресценции зонда SBFI в [Na+]вн выполняют процедуру калибровки.

Концентрацию ионов натрия в везикулах рассчитывают по формуле:

[Na+]цит = Kd × k × (R — Rmin)/(Rmax — R),

где R — отношение флуоресценции при длинах возбуждающего света 340 нм (F340) и 380 нм (F380); R min и Rmax — то же при нулевой и насыщающей концентрации [Na+]цит (150 mM); k — отношение интенсивности флуоресценции при 380 нм для свободного и связанного зонда (2,1 ± 0,1); Kd — равновесная константа диссоциации комплекса зонд-Na, равная 20,8 ± 1,4 мМ.

Определение изменений содержания ионов хлора ([Cl–]вн) в изолированных синаптосомах основано на использовании флуоресцентного индикатора Cl–, 6-метокси-N-этил- хинолина йодида. Минимальное значение флуоресценции (Fmin) определяют после инкубации везикул в течение 10 мин в присутствии 150 мМ KSCN и 25 мкМ валиномицина. При этом анион KSCN– вытесняет Cl– из комплекса с красителем, валиномицин служит в качестве ионофора, переносящего KSCN– через плазматическую мембрану в везикулы. Для определения величины константы Штерна-Волмера экспериментальные данные представляют в следующих координатах:

Fo/FCl– ; [Cl–],

где Fo= Fmax – Fmin, FCl– — значение флуоресценции при заданной концентрации ионов хлора в среде ([Cl–]).

Везикулярную концентрацию хлора в исследуемых образцах рассчитывают на основании построенной калибровочной кривой, подставляя экспериментальное значение флуоресценции образцов.

Для определения содержания цАМФ в синаптосомах используют стандартные наборы фирмы «Amersham». Содержание инозитол-трифосфата определяют радиометрически.

408

Активацию рецепторов осуществляют путем внесения в суспензию синаптосом, выделенных из вентролатеральных отделов продолговатого мозга, селективных агонистов соответствующих типов рецепторов (табл. 1).

Таблица 1 Используемые в работе специфические лиганды различных типов рецепторов

Сокращения: 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (8-OH-DPAT); alpha-methyl-5- hydroxytryptamine (α-Me-5HT); CGS19755 (selfotel) = memantine; D-2-amino-4-phospho- nobutanoic acid (D-AP4); methyl-4-carboxyphenylglycine (MCPG).

Для оценки специфичности выявленных изменений в качестве контроля используют избирательные антагонисты/ингибиторы изучаемых в работе рецепторных систем.

Расчет доверительных интервалов экспериментальных значений и оценку достоверности различий между ними проводят с помощью параметрического t-критерия Стьюдента при уровне значимости, равном 0,05.

4. Общие фармакологические свойства, аритмогенное действие и токсичность изучаемых соединений

4.1. Методы, позволяющие выявить общую фармакологическую активность антиаритмических лекарственных средств

4.1.1. Использование методов радиолигандного связывания для исследования спектра взаимодействия изучаемых соединений

смембранными рецепторами различных типов

Внастоящее время для изучения характера действия исследуемых химических веществ широко применяют методы радиолигандного связывания. Методы радиолигандного анализа позволяют выявить мишени — специфические рецепторы, через которые вещество влияет на метаболизм клетки. Изучение механизмов взаимодействия химических соединений с различными типами рецепторов позволяет выявить те особенности строения вещества, которые определяют его свойства, и на этой основе сформулировать требования к направленному синтезу новых соединений. С другой стороны, представляет значительный интерес исследование спектра взаимодействия уже изученного нового препарата с мембранными рецепторами различных типов. Для изучения антиаритмических препаратов представляет интерес исследование связывания соединений с рецепторами натриевых, кальциевых и калиевых каналов, муска-

риновыми рецепторами (М1М2); α1,α2-адренорецепторами, β1,β2-адренорецепторами, дофаминовыми, D2-рецепторами, гистаминовыми рецепторами и т. д. Определяют константы связывания исследуемого соединения с мембранными рецепторами различных типов.

409

4.1.2.Исследование влияния на сердечно-сосудистую систему

Висследованиях на наркотизированных или бодрствующих собаках или кошках регистрируют артериальное давление и деятельность сердца (частоту сердечных сокращений, ударный и минутный объемы, сократительную функию миокарда). Влияние на сократимость имеет большое значение для оценки нового антиаритмического препарата. Так как угнетение сократимости присуще многим антиаритмическим веществам, важно выяснить, насколько интенсивно оно выражено. В той же степени это относится

ик влиянию нового соединения на частоту сердечных сокращений и функцию проведения.

4.1.3.Исследование влияния на вегетативный отдел нервной системы

Исследование проводят на целом животном (наркотизированные кошки) и на изо-

лированных органах (изолированные отрезки кишечника). На целом животном изучают влияние вещества на реакции артериального давления, вызванные введением адреналина, норадреналина, ацетилхолина, а также раздражением периферического отдела блуждающего нерва, а также на сокращение третьего века у кошек при раздражении симпатического нерва на шее.

В исследованиях на изолированных отрезках кишечника исследуют влияние веществ на спазм кишечника, вызванный ацетилхолином.

4.2. Исследование острой и хронической токсичности, аритмогенного (проаритмического) действия изучаемых веществ

4.2.1. Исследование острой и хронической токсичности изучаемых веществ

Острую токсичность изучают на первом этапе исследований, вычисляют ЛД50 и терапевтическую широту (ЛД50/ЭД50). При этом ЭД50 можно взять из результатов исследований, полученных на аконитиновой или хлоридкальциевой модели.

Хроническую токсичность изучают так же, как и для соединений другого типа действия. Длительность введения вещества зависит от того, в какой лекарственной форме предполагается применять препарат.

В связи с тем, что для купирования или профилактики аритмий требуются различные по длительности курсы лечения, а также разные способы введения препаратов (внутрь или парентерально в виде одномоментной струйной или длительной капельной инфузии), особое значение для выбора оптимально эффективных доз имеет изучение фармакокинетики.

4.2.2. Исследование проаритмического действия изучаемых соединений

Выраженность проаритмического действия имеет большое значение для оценки нового соединения, предлагаемого в качестве антиаритмического препарата. Проаритмическое действие является одним из самых неприятных побочных явлений антиаритмических средств.

Под проаритмическим действием антиаритмических средств понимают следующее: I. Ухудшение течения существующих аритмий:

А. Увеличение числа желудочковых экстрасистол или появление парных желудочковых экстрасистол или коротких эпизодов пароксизмальных желудочковых тахикардий.

Б. Переход коротких пароксизмов желудочковых тахикардий в более длительные периоды желудочковых тахикардий.

В. Увеличение частоты длительных периодов желудочковой или наджелудочковой тахикардий.

Г.Увеличение продолжительности периодов длительной желудочковой или наджелудочковой тахикардий.

410