3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

Через правую яремную и правую бедренную вену в правое предсердие вводят 2 биполярных зонда с межполюсным расстоянием 1,0–1,5 мм, один из которых предназначен для раздражения миокарда электрическими импульсами, а другой — для регистрации внутрипредсердной ЭКГ, максимальным зубцом которой является зубец Р (2,0–2,5 мВ) (техника изготовления электродов изложена ниже в разделе 2.1.3.1.).

Для раздражения блуждающего нерва и правого предсердия используют 2 электростимулятора, способных работать либо в периодическом, либо в залповом режиме, обеспечивающем подачу на нерв или миокард одиночного раздражения из 1–3 импульсов. Для получения такого раздражения электрокардиографический сигнал подается на устройство, выделяющее зубец Р ЭКГ и запускающее от него (с необходимой задержкой) «предсердный» или «вагусный» стимулятор, находящийся в ждущем режиме.

Для получения нейрогенной фибрилляции предсердий предварительно определяют пороговую силу раздражения блуждающего нерва (обычно 0,3–0,4 В), вызывающую 10% удлинение интервала РР ЭКГ при раздражении нерва в периодическом режиме (2 мс, 40 Гц) в течение 5 с.

После этого определяют хронотропный эффект блуждающего нерва, нанося на него одиночный залп из 3-х импульсов (2 мс, 40 Гц, 6 порогов) синхронно с зубцом Р ЭКГ. Выраженность хронотропного эффекта (ХЭ, %) оценивают по формуле: ХЭ = 100 (Тс — Тп)/Тп, где Тп – длительность последнего интервала РР перед раздражением нерва, а Тс – длительность следующего за ним интервала РР, совпадающего по времени с нанесением на нерв серии импульсов.

Затем определяют конечно-диастолический порог раздражения миокарда, периодически нанося в конечную фазу цикла РР ЭКГ постепенно нарастающие по амплитуде одиночные электрические импульсы длительностью 5 мс, и так до тех пор, пока не появится первая экстрасистола. Установив диастолический порог раздражения, увеличивают его в 4 раза и определяют абсолютный рефрактерный период предсердия, постепенно укорачивая время задержки тестирующего импульса, и так до тех пор, пока не перестанут возникать экстрасистолические возбуждения предсердий.

После указанной подготовки включают периодическое раздражение блуждающего нерва (2 мс, 40 Гц, 6 порогов) и на фоне наступившей остановки сердца наносят на предсердие одиночную пару импульсов (5 мс, 25 Гц, 4 порога), что приводит к пароксизму нейрогенной фибрилляции предсердий продолжительностью до 3–6 мин (при условии продолжения стимуляции блуждающего нерва). В случае прекращения вагусной стимуляции фибрилляция миокарда немедленно прекращается, но так же легко может быть вызвана вновь через 1–2 мин. Исследование антиаритмического эффекта изучаемого вещества осуществляется следующим образом. Сначала определяют исходную длительность пароксизма нейрогенной фибрилляции предсердий при установленных параметрах функционального состояния блуждающего нерва и сердца (порог раздражения и хронотропный эффект нерва, длительность интервалов РР и РQ ЭКГ, диастолический порог и абсолютный рефрактерный период правого предсердия).

После этого вводят в кровь необходимое количество изучаемого вещества, и через 5, 30, 60, 90, 120 мин повторяют определение всех перечисленных показателей, отмечая наличие или отсутствие кардиотропного и/или нейротропного эффекта.

Для каждой концентрации изучаемого вещества выполняют 5–7 экспериментов с обобщением результатов в виде таблицы.

Об эффективности изучаемого соединения судят по его способности предупреждать развитие нейрогенной фибрилляции предсердий. Эффект изучаемого соединения сравнивают с действием референтных антиаритмических препаратов, обладающих холинолитической активностью (например, антиаритмик IA класса прокаинамид и антиаритмик IC класса этацизин).

Таким образом, преимуществами описываемой методики являются: 1) возможность получения фибрилляции на совершенно здоровых животных без предварительного по-

391

вреждения миокарда; 2) полностью обратимый характер аритмогенного воздействия на миокард; 3) произвольно осуществляемый механизм получения и прекращения аритмии, что позволяет на одном и том же животном изучать динамику аритмогенного или антиаритмического эффекта при постепенном увеличении дозы изучаемого вещества.

2.1.1.3. Техника изготовления внутрисердечных электродов для мелких лабораторных животных

В ходе фармакологических исследований нередко возникает потребность в раздражении миокарда или регистрации его электрической активности у мелких животных in situ, что требует применения соответствующих по размеру внутрисердечных электродов. В связи с этим предлагается простейшая методика изготовления указанных электродов в лабораторных условиях, в частности, для кошек.

К одному из полюсов на выходе лабораторного трансформатора присоединяют лакированный медный провод (длиной 50–70 см и диаметром 0,15–0,2 мм), а к другому полюсу — обычный сетевой провод (длиной около 50 см), свободный конец которого припаян к металлическому колпачку угольного стержня (диаметр 7–8 мм), извлекаемого из круглой бытовой электробатарейки (1,5 В). Затем включают трансформатор, устанавливают выходное напряжение на уровне 10–20 В и на долю секунды прикасаются тонким проводом к свободному торцу угольного стержня. Возникающая при этом электрическая дуга мгновенно оплавляет конец провода в виде шарика диаметром 0,8–1,0 мм. После этого укорачивают оплавленный провод до 45 см и вводят его обрезанным концом в сосудистый катетер длиной 40 см (внутренний диаметр 0,4 мм, наружный диаметр 1,0–1,2 мм). Натянув провод в катетере до упора (то есть до заклинивания шариком отверстия в катетере), опускают кончик катетера с выглядывающим из него металлическим шариком в эфир на глубину 2–3 мм. Через 1–2 мин кончик катетера размягчается, что позволяет втянуть шарик внутрь катетера на 5–7 мм. Подсушивают заготовку до восстановления твердости катетера, после чего под лупой обрезают его бритвой по экватору шарика и несколько раз покрывают конец конструкции лаком для ногтей. Тщательно просушивают изделие, после чего мелкой наждачной шкуркой счищают лак с центральной (то есть выступающей из катетера) части металлического шарика. На противоположный конец катетера плотно натягивают 5–6 см более широкой и более мягкой пластиковой трубочки, пропуская внутри нее выступающий из катетера электродный провод. Последний припаивают к мягкому многожильному проводу (длиной 8–10 см) с внешним диаметром изоляции, равным наружному диаметру катетера, после чего оттягивают мягкую трубочку назад, закрывая место спайки электрода и многожильного провода. К свободному концу многожильного провода припаивается клемма для подключения электрода к электростимулятору или электрокардиографу (желательно через удлинитель). Чтобы получить биполярный электрод, изготавливают 2 одинаковых униполярных электрода, которые скрепляются затем вместе 4–5 растягивающимися колечками (шириной 1,5–2,0 мм), нарезанными из вышеописанной мягкой трубочки.

2.1.2. Исследование эффективности изучаемых соединений на моделях желудочковых нарушений ритма сердца

2.1.2.1. Исследование эффективности изучаемых соединений на модели двустепенной перевязки коронарной артерии [24]

Исследования проводятся на бодрствующих беспородных собаках обоего пола массой 10–15 кг. За сутки до эксперимента животных наркотизируют (пентобарбитал натрия 40 мг/кг внутривенно или этаминал-натрия 40 мг/кг внутриплеврально) до уровня IIIа хирургического наркоза, интубируют и переводят на искусственное дыхание кислородновоздушной смесью в соотношении 1:1. Животных фиксируют на операционном столе в положении на правом боку, проводят торакотомию по 4-му межреберью, после чего при

392

помощи ранорасширителя формируют операционное окно приблизительно 7×7 см, проводят перикардотомию и на расстоянии 1–2 см ниже ушка выделяют 0,5 см нисходящей ветви левой коронарной артерии, под которую подводят две лавсановые лигатуры. Затем на выделенный участок коронарного сосуда (по длиннику) накладывают атравматическую хирургическую иглу № 6, затягивают на ней одну лигатуру, после чего иглу извлекают. Эта манипуляция воспроизводит частичную окклюзию коронарного сосуда и в существенной мере снижает риск развития фибрилляции желудочков сердца. Через 30 мин производят полную окклюзию коронарного сосуда путем затягивания второй лигатуры. В рану вводят антибиотики, ребра стягивают лигатурами и рану послойно ушивают. Для введения изучаемых соединений катетеризируют наружную яремную вену, свободный конец катетера выводят на холку животного. После восстановления у животного зрачкового рефлекса, что обычно совпадает с временем восстановления самостоятельного дыхания (3–5 ч от момента дачи наркоза), его отключают от аппарата искусственного дыхания и деинтубируют.

Через 24 ч после перевязки коронарной артерии животных берут в эксперимент и регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение, продолжительность записи 3 раза по 60 с). Для дальнейшего исследования отбирают только тех животных, у которых регистрируется стойкая желудочковая экстрасистолия или желудочковая тахикардия. Количество эктопических сокращений не менее 70–75% (по результатам трех измерений). Затем внутривенно вводят изучаемое соединение (болюсом, медленно струйно или капельно; способ введения определяет предполагаемая схема применения изучаемого соединения в клинике).

Об эффективности изучаемого соединения судят по его способности восстанавливать нормальный сердечный ритм. В качестве референтных препаратов используют антиаритмики I класса.

Модификация метода Harris [24] позволяет оценить влияние изучаемых соединений на аритмогенез в острую фазу инфаркта миокарда. Для проведения подобного рода экспериментов необходимо наличие оборудования, позволяющего проводить суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру. Животных наркотизируют, переводят на искусственное дыхание и при помощи рекордера в течение 1 ч регистрируют ЭКГ. Затем животных оперируют по вышеприведенной методике. Рану послойно зашивают и через час после операции начинают регистрацию ЭКГ, которую продолжают в течение 24 ч. Медикаментозный сон у животных поддерживают путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия (20 мг/кг 1 раз в 4–5 ч).

Изучаемое соединение при помощи инфузионного насоса вводят внутривенно с постоянной скоростью и в постоянном объеме, начиная с первого часа после операции, и продолжают в течение суток (скорость введения подбирают таким образом, чтобы в 1 ч была введена 1/24 от среднесуточной дозы соединения). Об эффективности изучаемого вещества судят по его способности подавлять злокачественные нарушения ритма сердца. В качестве референтного препарата используют антиаритмик I В класса лидокаин [11].

Эксперименты проводятся также на беспородных собаках [5, 11, 24].

Через 24 ч после вышеописанной подготовки животных электрокардиографически определяют процент эктопических сокращений желудочков по отношению к общей частоте сокращений сердца за 1 мин. Проводят две серии исследований. В первой — определяют пороговые антиаритмические дозы исследуемого вещества и референтного препарата.

При этом учитывают время достижения максимального антиаритмического действия и время уменьшения антиаритмического эффекта на 50% после внутривенного введения исследуемого вещества и референтного препарата. Первоначально изучаемые соединения и препарат сравнения вводят в минимальных дозах. В случаях отсутствия антиаритмического действия избранных доз веществ увеличивают их в 2 раза до тех пор, пока не будут определены их минимальные (пороговые) дозы, вызывающие снижение эктопических сокращений желудочков более чем на 50%. Одноминутные ЭКГ-записи осуществляют с интервалом 2 (до 10 мин после введения вещества) и 5 мин в течение 70 мин. Во второй серии — исследуют пороговые и изотоксические дозы изучаемого вещества и референтного

393

препарата. При этом частоту сердечных сокращений и эктопические сокращения желудочков (в %) учитывают до введения веществ (фон), затем через 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 и более мин после их инъецирования до возвращения фоновых значений или полного купирования нарушений ритма сердца.

2.1.2.2. Исследование эффективности изучаемых соединений на модели желудочковых аритмий, вызванных цезия хлоридом

Исследование проводится на наркотизированных (уретан 1,0–1,3 г/кг, внутрибрюшинно) нелинейных крысах-самцах массой 200–250 г. Наркотизированных животных фиксируют на операционном столе в положении на спине. Перед началом эксперимента у животных регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение, продолжительность записи 30 с). Затем подбирают дозу цезия хлорида, которая во всех экспериментах вызывает злокачественные желудочковые нарушения ритма сердца, в том числе и тахикардию типа «пируэт». Обычно аритмогенная доза цезия хлорида колеблется в пределах от 1 до 5 мМ/кг, в среднем 3 мМ/кг, что равно 504 мг/кг. Эффективная доза препарата вызывает стойкие злокачественные нарушения ритма сердца — политопную желудочковую экстрасистолию, желудочковую тахикардию, тахикардию типа «пируэт», переходящую в фибрилляцию желудочков сердца.

После проведения контрольной серии экспериментов рассчитывают процент животных, у которых цезия хлорид вызвал желудочковую экстрасистолию, желудочковую тахикардию, тахикардию типа «пируэт».

Изучаемое соединение вводят за 5–10 мин до введения цезия хлорида (в ранее подобранной дозе). Об эффективности изучаемого соединения судят по его способности предотвращать развитие злокачественных нарушений ритма сердца. В качестве референтных препаратов используют антиаритмики I и III класса по классификации Е.М.Vaughan Williams. Поскольку нарушения ритма сердца, вызванные цезия хлоридом, обусловлены его способностью блокировать трансмембранные потенциалзависимые калиевые каналы, на этой модели наиболее эффективны антиаритмики III класса.

2.1.3. Исследование эффективности изучаемых соединений на модели реперфузионных аритмий

2.1.3.1. Исследование эффективности изучаемых соединений на модели реперфузионных аритмий в исследованиях на кошках

Исследования проводятся на наркотизированных (пентобарбитал натрия 40 мг/кг внутривенно или этаминал-натрия 40–50 мг/кг внутрибрюшинно) беспородных кошках обоего пола массой 2,5–3,5 кг. Животных после трахеотомии переводят на искусственное дыхание кислородно-воздушной смесью в соотношении 1:1 (возможно дыхание комнатным воздухом). Животных фиксируют на операционном столе в положении на спине. После проведения торако- и перикардотомии под нисходящую ветвь левой коронарной артерии на расстоянии 0,5–1 см от ее выхода из-под ушка сердца подводят лигатуру. Катетеризируют бедренную артерию для регистрации артериального давления и бедренную вену — для введения исследуемых соединений. Регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение, длительность регистрации 60 с). Затем при помощи окклюдера пережимают коронарную артерию. Через 30 мин окклюдер снимают. Запись регистрируемых показателей проводят перед снятием окклюдера, а затем на 5, 10, 15, 20 и 30 минуте от момента снятия окклюдера. На 1–3 минуте после снятия окклюдера у животных развивается политопная желудочковая экстрасистолия, которая у 40–60% животных переходит в фибрилляцию желудочков сердца. Изучаемое соединение вводят внутривенно в 1 мл растворителя за 5 мин до снятия окклюдера. Об эффективности исследуемого соединения судят по его возможности предотвращать развитие злокачественных нарушений ритма сердца.

В качестве референтных веществ используют антиаритмические препараты IA, IC и IV класса по классификации Е.М. Vaughan Williams [39].

394

В этих же экспериментах, помимо оценки антиаритмического действия изучаемых соединений, возможна оценка их влияния на основные показатели гемодинамики и деятельности сердца. Для этой цели левый желудочек сердца катетеризируют для измерения внутрисердечного давления, а на восходящую часть дуги аорты помещают датчик электромагнитного или ультразвукового расходомера.

2.1.3.2. Исследование эффективности изучаемых соединений на модели реперфузионных аритмий в исследованиях на крысах

Исследования проводятся на наркотизированных (пентобарбитал натрия, 60 мг/кг, внутрибрюшинно) нелинейных крысах-самцах массой 180–240 г. Животных после трахеотомии переводят на искусственное дыхание комнатным воздухом (может быть использован аппарат искусственной вентиляции легких для грызунов Rodent Ventilator, UGO BASILE (Италия)). Крыс фиксируют на операционном столе в положении на спине. После проведения торако- и перикардотомии под нисходящую ветвь левой коронарной артерии на расстоянии 1–2 мм от ее выхода из-под ушка сердца подводят лигатуру. Регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение, длительность регистрации 30 с). Затем при помощи окклюдера пережимают коронарную артерию и через 7 мин производят реперфузию. Запись регистрируемых показателей проводят перед снятием окклюдера, а затем на 1, 3, 5, 10 и 15 минуте от момента снятия окклюдера. Через 1–2 мин после снятия окклюдера у животных развивается политопная желудочковая экстрасистолия, которая у 70% животных переходит в фибрилляцию желудочков сердца. Исследуемое соединение вводят внутривенно в 0,3–0,5 мл физиологического раствора или воды для инъекций за 5–6 мин до снятия окклюдера.

Об эффективности изучаемого соединения судят по его возможности предотвращать развитие злокачественных нарушений ритма сердца.

В качестве референтных препаратов используют антиаритмические препараты IA, IC и IV класса по классификации Е.М. Vaughan Williams [39].

2.1.4. Исследование противофибрилляторной активности изучаемых соединений на моделях фибрилляции желудочков

2.1.4.1. Исследование противофибрилляторной активности изучаемых соединений в исследованиях на кошках с интактным и ишемизированным миокардом

Исследования проводятся на наркотизированных (пентобарбитал натрия 40 мг/кг внутривенно или этаминал-натрия 40 мг/кг внутрибрюшинно) беспородных кошках обоего пола массой 2,5–3,5 кг. Животных фиксируют на операционном столе в положении на спине, затем производят трахеотомию и переводят их на искусственное дыхание кислородно-воздушной смесью в соотношении 1 : 1 (возможно дыхание комнатным воздухом). После проведения торако- и перикардотомии в миокард левого желудочка (верхняя треть) вводят два позолоченных электрода на расстоянии 0,5 см друг от друга. Регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение, длительность регистрации 60 с) и артериальное давление в бедренной артерии. Порог электрической фибрилляции сердца определяют повторяющимся сканированием уязвимого периода сердечного цикла серией из 20 прямоугольных импульсов постоянного тока увеличивающейся силы до возникновения фибрилляции. Если фибрилляция через 60 с самостоятельно не проходит, работу миокарда восстанавливают разрядом дефибриллятора (в режиме зарядки 20–50 Дж). За порог фибрилляции принимают минимальную силу тока, стабильно вызывающую фибрилляцию желудочков (длительностью более 60 с) при повторной стимуляции. После определения порога фибрилляции сердца животным дают «отдохнуть» 10–15 мин, после чего внутривенно в 1 мл растворителя вводят изучаемое соединение и определяют порог электрической фибрилляции сердца. Запись регистрируемых показателей производят

395

сразу же по окончании стимуляции левого желудочка сердца. Об эффективности изучаемых соединений судят по их способности повышать порог электрической фибрилляции сердца.

В качестве референтных препаратов используют антиаритмические средства I и

IIIкласса по классификации Е.М. Vaughan Williams.

Исследования по изучению противофибрилляторной активности изучаемых со-

единений у животных с ишемизированным миокардом проводятся по аналогичной схеме. Ишемию миокарда вызывают одномоментной перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии на границе ее верхней и средней трети. Порог электрической фибрилляции определяют до и через 30 мин после перевязки коронарной артерии. При адекватном проведении экспериментов через 30 мин ишемии порог фибрилляции снижается на 10–15 и более процентов. Изучаемое соединение вводят внутривенно в 1 мл физиологического раствора или воды для инъекций через 30 мин после перевязки коронарной артерии (сразу же после повторного определения порога).

2.1.4.2. Исследование противофибрилляторной активности изучаемых соединений в исследованиях на собаках [29]

Исследования проводятся на наркотизированных (пентобарбитал натрия 40 мг/кг внутривенно или этаминал-натрия 40 мг/кг внутриплеврально) собаках массой 7–12 кг. Животных наркотизируют до IIIа уровня хирургического наркоза, после чего интубируют и переводят на искусственное дыхание кислородно-воздушной смесью в соотношении 1 : 1 (возможна вентиляция комнатным воздухом). После торако- (по 4-му межреберью) и перикардотомии под нисходящую ветвь левой коронарной артерии на расстоянии 0,5– 1 см после ее выхода из-под ушка сердца подводят лигатуру. Регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение, длительность регистрации 60 с). Затем проводят одномоментную перевязку коронарной артерии. Как правило, в первые 1–7 мин после перевязки коронарной артерии у 80% животных развивается политопная желудочковая экстрасистолия, сменяющаяся желудочковой тахикардией, переходящей в фибрилляцию желудочков.

Изучаемое соединение вводят за 5 мин до одномоментной перевязки коронарной артерии. Регистрацию ЭКГ проводят перед окклюзией и через 1, 3, 5, 10, 15 и 20 мин после перевязки коронарной артерии.

Об эффективности изучаемых соединений судят по их способности предотвращать развитие фибрилляции желудочков сердца.

Вкачестве референтных препаратов используют антиаритмические средства I и III класса по классификации Е.М.Vaughan Williams.

2.1.4.3. Исследование противофибрилляторной активности изучаемых соединений на модели электрической фибрилляции желудочков сердца в исследованиях на крысах

Исследование проводится на наркотизированных нелинейных крысах-самцах массой 300–400 г. Животных фиксируют на операционном столе в положении на спине, производят трахеотомию и переводят на искусственное дыхание комнатным воздухом. После торако- и перикардотомии в миокард левого желудочка вводят два позолоченных электрода (расстояние между электродами 0,3–0,5 см). Регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение). Порог электрической фибрилляции сердца определяют повторяющимся сканированием уязвимого периода сердечного цикла серией из 20 прямоугольных импульсов постоянного тока увеличивающейся интенсивности. За порог фибрилляции желудочков принимают минимальную силу тока, вызывающую при двукратном повторении фибрилляцию желудочков. В исследование отбирают животных, у которых фибрилляция желудочков развивается при силе тока не более 6 мА. После определения порога фибрилляции животным дают «отдохнуть» 10–20 мин, затем внутривенно в 0,3–0,5 мл

396

физиологического раствора или воды для инъекций вводят изучаемое соединение и через 3–5 мин определяют порог электрической фибрилляции сердца. Об эффективности изучаемых соединений судят по их способности увеличивать порог электрической фибрилляции сердца.

Вкачестве референтных препаратов используют антиаритмические средства I и III класса по классификации Е.М.Vaughan Williams.

2.1.5.Исследование вклада кардиальных

иэкстракардиальных механизмов в реализацию антиаритмического

(антифибрилляторного) действия изучаемых соединений

Эксперименты проводятся на наркотизированных (пентобарбитал натрия 40 мг/кг внутривенно или этаминал-натрия 40 мг/кг внутрибрюшинно) беспородных кошках обоего пола массой 2,5–3,5 кг. Животных после трахеотомии переводят на искусственное дыхание кислородно-воздушной смесью в соотношении 1 : 1 (возможно дыхание комнатным воздухом), фиксируют на операционном столе в положении на спине, проводят торако- и перикардотомию. Денервацию сердца производят следующим образом: на уровне щитовидного хряща пересекают правый и левый №.vagus, а затем производят экстирпацию правого и левого звездчатых ганглиев, расположенных на задней поверхности верхней трети средостения, прилегающей к позвоночному столбу (справа и слева). Об эффективности денервации сердца судят по статистически значимому урежению частоты сердечных сокращений.

Порог электрической фибрилляции сердца определяют до и после денервации сердца. Затем внутривенно в 1 мл растворителя вводят изучаемое соединение и оценивают его влияние на величину порога электрической фибрилляции сердца.

В тех случаях, когда порог интактного и денервированного сердца не различается, высказывают предположение о том, что вклад экстракардиальных механизмов в реализацию антиаритмического действия изучаемого соединения незначителен.

2.2. Исследование антиаритмической активности изучаемых соединений при нарушениях сердечного ритма центрального генеза

Известно, что сердечные аритмии часто являются следствием нарушения нервной регуляции сердечного ритма.

В ряде экспериментальных работ убедительно показано, что стимуляция электрическими импульсами или химическими агентами определенных структур мозга в области коры, гипоталамо-гипофизарной и лимбической систем, продолговатого мозга индуцирует проявление различных форм аритмий — от синусовой тахикардии до фибрилляции желудочков.

Нарушения ритма сердца центрального происхождения могут иметь место у пациентов с различными неврологическими заболеваниями, особенно часто — с нарушениями мозгового кровообращения. Постоянно возрастает удельный вес расстройств сердечного ритма психосоматического генеза. Это диктует необходимость создания антиаритмических ЛС соответствующей направленности действия.

2.2.1. Исследование влияния изучаемых соединений на аритмии, вызванные введением в IV желудочек мозга аконитина, строфантина К и цезия хлорида

Эксперименты проводят на наркотизированных (внутрибрюшинно 40 мг/кг α-хлоралозы и 30 мг/кг этаминал-натрия) кошках массой 2,5–3,5 кг. Животных укладывают на столик спиной кверху, голову фиксируют зажимами под углом 45° по отношению к туловищу. Затем иглой (с мандреном) для внутримышечных инъекций пунктируют IV желудочек мозга, при этом иглу вводят по заднему краю большого затылочного отверстия на глубину 0,7–1 см, мандрен извлекают, после чего в просвете

397

иглы должен появиться ликвор, что свидетельствует о нахождении иглы в IV желудочке мозга. Для предотвращения истекания ликвора отверстие иглы закрывают пробкой. Спустя 7–10 мин фиксируют ЭКГ во II стандартном отведении. Аритмогенные вещества — аконитин [2–6 мкг/кг в растворе 1 : 20000], строфантин К [0,01–0,050 мг/кг в растворе 1 : 5000] и цезия хлорид [0,5–1,5 мг/кг в 1% растворе] вводят каждые 3–5 мин (с шагом: для первого вещества 2 мкг/кг, для второго — 0,01 мг/кг, для третьего — 0,5 мг/кг) в возрастающих дозах в IV желудочек мозга до появления стойких нарушений сердечного ритма. Через 5–7 мин внутривенно вводят изучаемое соединение в ранее определенных антиаритмических дозах. При наличии антиаритмического эффекта изучаемое вещество (в дозе 10–15 раз меньшей, чем для внутривенного введения) может быть инъецированно (на фоне аритмии) непосредственно в IV желудочек мозга. В качестве референтных препаратов могут быть избраны антиаритмики, устраняющие нарушения сердечного ритма переферического генеза, вызванные аконитином, строфантином К и цезия хлоридом.

2.2.2. Исследование влияния изучаемых соединений на аритмии, индуцированные электрораздражением нейроструктур головного мозга

Исследования могут быть проведены на собаках, кошках или кроликах массой 8–10, 3,0–4,0 и 2,5–3,5 кг соответственно.

Исследования на собаках. Для раздражения структур гипоталамуса наркотизированным (этаминал-натрия 40–50 мг/кг внутриплеврально) собакам вживляются нихромовые биполярные электроды (межэлектродное расстояние 1–1,2 мм) согласно атласу головного мозга для собак и фиксируются к костям черепа с помощью быстро твердеющей массы «Стиракрил». После операции вживления электродов исследования начинают проводить не ранее чем через 6–7 суток. Во время исследования животные находятся в станке в положении стоя. В экспериментах регистрируется ЭКГ в стандартных отведениях. Гистологический контроль локализации электродов проводится после коагуляции зоны раздражения. Стимуляция нервных образований гипоталамуса осуществляется прямоугольными импульсами тока с переменным напряжением (1–12 В), частотой (50–250 Гц) и постоянной длительностью импульса в 1 мс с использованием электростимулятора, позволяющего задавать соответствующие параметры. Продолжительность стимуляции 15 с.

При раздражении ретикулярного гигантоклеточного ядра ретикулярного каудального ядра моста, медиального и латерального преоптического и супраоптического ядер наиболее частой формой нарушений сердечного ритма является вентрикулярная экстрасистолия.

При стимуляции ретикулярного ядра моста, ретикулярного мелкоклеточного ядра и ядер вестибулярного комплекса наиболее часто наблюдается политопная вентрикулярная экстрасистолия.

Атриовентрикулярный (узловой) ритм развивается на фоне брадикардии при активации ретикулярного гигантоклеточного ядра и ретикулярного ядра покрышки.

Синусовая аритмическая брадикардия наблюдается на фоне раздражения структур ретикулярного гигантоклеточного ядра.

Следует отметить, что при стимуляции ретикулярного, мелкоклеточного и гигантоклеточного ядер и структур вестибулоспинального тракта может иметь место симптоматика нарушений коронарного кровообращения: смещение интервала S–T от изолинии, инверсия или увеличение вольтажа зубца Т ЭКГ [34].

Исследуемые вещества и референтные препараты (в избранных дозах) вводят собакам внутривенно перед (превентивное действие) или на фоне (купирующее действие) получения (в контроле) стойких нарушений сердечного ритма. ЭКГ регистрируют через избранные временные интервалы.

Исследования на кошках. Вживление электродов в вышеотмеченные структуры головного мозга осуществляют подобно экспериментам на собаках. Исследования изучаемых

398

веществ (при избранном пути введения) начинают проводить на наркотизированных кошках через 6–7 дней после вживления электродов. ЭКГ регистрируют согласно избранному алгоритму.

Исследования на кроликах. Этапы вживления электродов в определенные структуры головного мозга практически соответствуют тем, что были избраны для собак и кошек. Погружение электродов в соответствующие структуры головного мозга осуществляется по координатам атласа Е. Фифкова и Дж. Маршала [13]. После операции вживления электродов исследования начинают проводить не ранее, чем через 5–7 дней. Гистологический контроль положения электродов осуществляют путем подготовки серии срезов мозга, окрашенных гематоксилином-эозином. Они сравниваются с аналогичными срезами соответствующего стереотаксического атласа.

Изучаемое вещество или референтный препарат (в определенных дозах) вводят в

краевую вену уха и затем регистрируют ЭКГ во II стандартном отведении в избранные временные интервалы.

2.2.3. Исследование влияния изучаемых соединений на центральные звенья симпатической регуляции сердечного ритма

Эксперименты проводят на кошках массой 2,5–3,5 кг, наркотизированных смесью α-хлоралозы и этаминал-натрия (50 и 10 мг/кг соответственно внутрибрюшинно). Вентральную поверхность продолговатого мозга обнажают путем удаления ската затылочной кости после предварительной ампутации гортани, глотки с языком и глубоких мышц шеи. После этого вскрывают твердую и мягкую мозговые оболочки. За точку отсчета (нулевой уровень) принимают середину корешков ХII пары черепно-мозговых нервов. Расположение определенных образований продолговатого мозга находят по соответствующим стереотаксическим атласам.

Локальную электростимуляцию продолговатого мозга осуществляют прямоугольными импульсами длительностью 0,2 мс, частотой 40 Гц и амплитудой 2–20 В при помощи монополярных вольфрамовых электродов (d = 100 – 150 мкм). Погружение электрода производят с помощью микроманипулятора с шаговым двигателем на глубину 1–2 мм от вентральной поверхности.

Химическую стимуляцию проводят микроинъекциями L-глутамата, который стимулирует только клеточные тела. Микроинъекции осуществляют с помощью микрошприца (цена деления 130 мкл). Глутамат (IM; рН 7,4–7,8) вводят в объеме 50–130 мкл.

ЭКГ регистрируют в специальном грудном отведении. ЧСС определяют при помощи анализатора сигналов «Ф-37». После накопления 100 циклов анализатор строит гистограмму, средняя ЧСС рассчитывается по ее пику. За исходную принимают ЧСС перед началом воздействия. Давление в аорте и левом желудочке регистрируют электроманометром. Запись ЭКГ, кривых давления в аорте и левом желудочке осуществляют на прямокоординатном самопишущем приборе, например «Н-3021/3».

Исследуемые соединения (в избранных дозах) и референтные препараты вводят внутривенно (лидокаин — 5 мг/кг, новакаинамид — 10 мг/кг, пропранолол — 0,5 мг/кг, амиодарон — 10 мг/кг, верапамил — 0,25 мг/кг) и в симпатоактивирующие нейрональные структуры продолговатого мозга в дозах, составляющих 1/1000 от внутривенных (лидокаин — 0,005 мг, новакаинамид — 0,010 мг, пропранолол — 0,0005 мг, амиодарон, верапамил — 0,00025 мг).

3. Исследование механизма действия отобранных соединений

Исследования, выполняемые на III этапе поиска и изучения механизма действия антиаритмических ЛС, требуют участия высококвалифицированных специалистов, занимающихся электрофизиологическими, биохимическими и радиолигандными методами исследования.

399

3.1. Изучение механизма действия соединений, проявивших высокую активность при нарушениях сердечного ритма периферического генеза

3.1.1. Метод микроэлектродной техники

Метод микроэлектродной техники позволяет изучать влияние соединений на потенциалы клеток ткани сердца, регистрируя разность потенциалов между внутренней и наружной средой клетки. Используют выделенные из различных отделов сердца полоски миокарда теплокровных животных (кролики, морские свинки, крысы и т. д.). Изучают влияние соединений на потенциал покоя, амплитуду потенциала действия, максимальную скорость деполяризации, длительность потенциала действия при различных уровнях реполяризации (на уровне 25%, 50% и 90% фазы реполяризации — action potential duration: APD25, APD50 и APD90 соответственно), пороговый и максимальный диастолический потенциал, абсолютный эффективный рефрактерный период, частоту генерации потенциалов действия. Параллельно оценивают изометрическую силу, регистрируемую у несокращающейся мышцы (или в период между сокращениями) при данной степени предрастяжения или растяжения препарата (resting force: RF), и изометрическую силу, регистрируемую у сердечной мышцы в период сокращения (active force: AF).

Для исследований применяют микроэлектроды, изготовленные из боросалицилатных марок стекла «Пирекс», «Феникс», «Кимакс», заполненные 2,5 М раствором KCl

иимеющие электрическое сопротивление, величина которого лежит в диапазоне от 5 до 20 МОм, что свидетельствует о высоком качестве колющей части. Для исследований спонтанно сокращающегося или стимулируемого фрагмента ткани миокарда используют «плавающий» тип фиксации микроэлектрода. Микроэлектрод в этом случае свободно завешивается над тканью на проволоке (90% платины и 10% иридия) диаметром 20–30 мкм, причем один из концов проволоки соединен с хлорсеребряной иглой, которая вводится в электролит микроэлектрода, а другой подсоединен к входу измерительной аппаратуры через соединительные провода. После введения микроэлектрода в клетку он колеблется в такт с сокращениями ткани и удерживается некоторое время во внутриклеточном положении.

Для измерения изометрической силы, регистрируемой у несокращающейся мышцы,

иу мышцы в период сокращения один конец ткани сердца жестко фиксируют, а другой присоединяют к механо-электрическому преобразователю.

3.1.2. Метод patch-clamp

Влияние соединений на ионные токи, протекающие через потенциалуправляемые ионные каналы мембраны рабочих кардиомиоцитов и клеток проводящей системы, проводят на клетках, изолированных из различных отделов сердца теплокровных животных (кролики, морские свинки, крысы и т. д.). На фоне действия соединений изучают либо суммарные ионные токи, текущие через мембрану, либо отдельно натриевые, калиевые и кальциевые токи, текущие через мембрану, либо токи, текущие через тот или иной тип одиночного потенциалуправляемого ионного канала. При этом метод позволяет регистрировать ионные каналы с изолированного кусочка мембраны, который может быть расположен по отношению к отверстию пипетки либо внешней, либо внутренней стороной. Дополнительно можно изучать параметры потенциала действия изолированного кардиомиоцита.

В основе этого метода лежат фиксация потенциала на мембране целой клетки или на фрагменте мембраны и измерение тока, протекающего через потенциалуправляемые ионные каналы. Для исследований применяют стеклянную микропипетку (patchпипетку) с оплавленным кончиком, которая имеет электрическое сопротивление от 1,5 до 2,5 МОм. Внутри пипетки, заполненной раствором электролита, располагается хлор-серебряный электрод, а второй электрод размещается внеклеточно в омывающей препарат жидкости.

400