3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

9.1.4. Модель сердечной недостаточности изолированных препаратов сердца, вызванная дефицитом кислорода

Моделирование сердечной недостаточности осуществляется при помощи аэрация изолированных органов газовой смесью, содержащей 5% О2, 5% СО2 и 90% N2 или 95% N2 и 5% СО2 ,что вызывает снижение параметров сократимости на 30—90% от исходного уровня в течение первых 10 мин. Сравнивая динамику и выраженность снижения параметров сократимости при введении в перфузат исследуемого вещества, можно судить о положительных свойствах соединения.

9.1.5. Определение острой токсичности исследуемых соединений

Острую токсичность веществ (ЛД50) определяют методом Личфилда и Уилкоксона (Беленький М.Л., 1968).

9.2. Методы изучения влияния веществ на параметры кардио- и гемодинамики животных

Минутный объем крови (МОК) является важнейшим показателем производительности сердца и лимитируется состоянием сократительного аппарата миокарда, степенью диастолического наполнения желудочка (преднагрузка), сопротивлением выбросу крови в аорте и легочной артерии (постнагрузка) и частотой сокращения сердца. Поэтому изменения МОК анализируют совместно с показателями сократительной активности миокарда.

9.2.1. Метод оценки сократительной активности миокарда путем катетеризации его полостей и записи внутрижелудочкового давления

Наркотизированным (этаминал натрия, 30 мг/кг) животных (собаки, кошки, кролики, крысы) через бедренную, сонную артерию и яремную вену в полости сердца вводят катетеры. Измеряют величину развиваемого давления в полостях сердца и его скорость, а также скорость укорочения и расслабления миокарда. Рассчитывают индексы сократимости [17, 25, 28]. По ЭКГ определяют ЧСС и другие показатели.

9.2.2. Изучение сократительной функции миокарда на основе анализа кривой фазового кровотока в восходящей части дуги аорты

Эксперименты проводятся на анестезированных животных (наркоз — этаминал натрия 30 мг/кг, внутрибрюшинно) (крысы, кошки, кролики, собаки и др.). После интубации трахеи и перевода животных на ИВЛ им производится торакотомия и перикардотомия, на восходящую часть дуги аорты помещают датчик электромагнитного или ультразвукового расходомера. Для измерения АД катетеризуют левую бедренную или сонную артерию, для введения препаратов — наружную яремную или правую бедренную вены. Для прямой оценки сократительных свойств миокарда в полость левого желудочка через верхушку сердца или путем катетеризации аорты можно ввести катетер для регистрации левожелудочкового давления и его производных [dP/dt и (dP/dt)/P]. На основании анализа кривой фазового кровотока в восходящей части дуги аорты [26] определяют время систолического выброса, время диастолического расслабления, ударный объем сердца (мл), минутный объем сердца (л/мин), максимальную линейную скорость кровотока в аорте (см/сек), максимальное ускорение кровотока в аорте (см/с2), характеризующее сократимость миокарда, индекс энергетических затрат, работу сердца и ОПСС. Частоту сердечных сокращений (уд/мин) рассчитывают, определяя время между двумя сердечными циклами. Для дальнейшего изучения отбираются вещества, влияющие на увеличение параметров сокращения и расслабления миокарда, МОК, УОК, снижающие ОПСС, не влияющие на электрофизиологические показатели сердца.

381

9.2.3. Модель острой левожелудочковой недостаточности у собак

Эксперименты проводятся на наркотизированных (нембутал 40 мг/кг внутривенно) собаках. После интубации трахеи и перевода животных на ИВЛ производятся торакотомия затем перикардотомия, выделяются участки огибающей и нисходящей ветви левой коронарной артерии. Под сосуды подводят лигатуры и последовательно перевязывают коронарные артерии, начиная с дистальных участков. Недостаток модели — частые фибрилляции желудочков сердца и высокий риск гибели животных.

9.3. Модели хронической сердечной недостаточности

9.3.1. Дозированный надклапанный стеноз аорты

Эксперименты проводятся на наркотизированных кроликах в условиях искусственной вентиляции легких. Животным производится торакотомия, надклапанный стеноз аорты воспроизводится затягиванием шелковой лигатуры на шаблоне диаметром 2,4 мм, что соответствует уменьшению наружного диаметра аорты в 2,5 раза. Клинические признаки и регуляторные нарушения, характерные для сердечной недостаточности, возникают через 1,5 месяца после операции. Недостатком модели является высокий процент гибели животных [8].

9.3.2. Модель изадриновой интоксикации у крыс

Эксперименты проводят на крысах массой 200–250 г. Животным контрольной группы животных подкожно вводят изадрин (новодрин) в дозе 80 мг/кг дважды с интервалом 24 ч. Введение больших доз изадрина вызывает повреждение b-адренорецепторов сердца и развитие некротических изменений в миокарде, что приводит к снижению физической работоспособности (плавательная проба, бег в тредбане), уменьшению устойчивости к гипоксии, увеличению ЧСС. Животным групп, получающим ЛС, наряду с изадрином вводится исследуемое вещество. С 5–7-го дня после введения 2-й дозы изадрина проводится исследование толерантности к физической нагрузке, функциональных возможностей миокарда [9].

9.3.3. Экспериментальный инфаркт миокарда у крыс, мышей

Эксперименты проводятся на наркотизированных животных (крысы, мыши). После интубации трахеи и перевода животных на ИВЛ производятся торакотомия и перкардотомия. Осуществляется перевязка нисходящей ветви левой коронарной артерии на границе верхней и средней трети. Затем осуществляется послойное ушивание раны, перед наложением заключительных швов воздух из грудной клетки удаляется с помощью резиновой трубки. Сердечная недостаточность развивается на 21 сутки (до 4–6 недель) [22, 24].

9.3.4.Метод определения функциональных резервов сердца

спомощью нагрузочных тестов

Изучение влияния вещества на функциональные резервы сердца осуществлялется на крысах и кошках с использованием нагрузочных проб: нагрузки объемом — быстрое, в течение 2 с, внутривенное введение животным физиологического раствора из расчета 0,3 мл/на 100 г массы; дозированной стимуляции адренорецепторов сердца — введение адреналина 0,1 мл (в разведении 10-7 г/мл) на 100 г массы животного, максимальной изометрической нагрузки — пережатие восходящей части дуги аорты на 30 с. Регистрация ЛЖД и его первой производной (dp/dt+ и dp/dt-) осуществляется электроманометром на механотронных датчиках с малым объемом смещения (0,05 мл на 250 мм рт.ст.). Перед проведением нагрузочных проб проводится следующая оперативная подготовка: после перевода животных на искусственную вентиляцию легких в четвертом межреберье осуществляются торакотомия, затем перикардотомия. Для измерения артериального давле-

382

ния катетеризируется левая общая сонная артерия. В полость левого желудочка через верхушку сердца вводится катетер для измерения левожелудочкового давления. Регистрируются следующие показатели кардио- и гемодинамики: максимальное левожелудочковое давление, скорость сокращения и расслабления миокарда (dр/dt+ и dр/dt-), частота сердечных сокращений. ИФС (интенсивность функционирования структур) и МИФС (максимальная интенсивность функционирования структур) определяются расчетным способом ((ЛЖД ср.х ЧССср)/масса левого желудочка +1/3 межжелудочковой перегородки) [14, 19].

Введение исследуемых веществ, физиологического раствора и адреналина осуществляется через катетер, имплантированный глубоко в правую наружную яремную вену. После периода стабилизации (10 мин) и записи исходных показателей животным последовательно проводятся нагрузочные пробы. После проведения экспериментов показатели кардиодинамики животных получающих ЛС и контрольной групп сопоставляются между собой. Если функциональные возможности сердца животных, получавших исследуемое вещество, оказываются выше, чем у животных контрольной группы, делается заключение о его позитивном воздействии на функциональные резервы сердца.

9.3.5.Изучение влияние соединений на метаболизм миокарда

—изучение влияния соединения на потребление сердцем О2 [10];

—определение содержания макроэргов (адениловых нуклеотидов, КФ) [1, 2] для выявления действия веществ на процессы синтеза или катаболизма макроэргов в кардиомиоцитах;

—определение активности креатинфосфокиназы характеризует скорость переноса энергии от мест образования к местам утилизации [6];

—изучение влияния соединения на утилизацию глюкозы (глюкозооксидазный метод) и содержание гликогена и жирных кислот в гомогенате сердечной мышцы по методам [23] позволяет судить об интенсивности использования и образования основных энергетических субстратов в миокарде;

—определение содержания пирувата и лактата в миокарде и крови, их соотношения, а также активность лактатдегидрогеназы позволяет судить о влиянии изучаемых соединений на интенсивность реакций аэробного и анаэробного окисления [13, 20];

—определение содержания субстратов и активности отдельных ферментов гликолиза

ицикла трикарбоновых кислот;

—определение содержания никотинамидных коферментов [7, 15];

—определение интенсивности окислительного фосфорилирования в митохондриях;

—влияние на активность К+-, Na+-АТФазы;

—влияние на активность аденилатциклазы и фосфодиэстеразы, функцию медленных кальциевых каналов, а также рецепторный аппарат сердца;

—влияние на концентрацию ионов натрия, калия, кальция, магния и др.;

—антиоксидантное действие [3,11,16];

—влияния на агрегантные свойства крови и систему гемостаза (см. методики в соответствующих разделах данного руководства).

Заключение

Выбор тех или иных методов диктуется конкретной задачей, стоящей перед исследователем. При этом изучаемые соединения, как минимум, не должны обладать аритмогенными, гипертензивными и агрегатными свойствами и не должны повышать потребность миокарда в кислороде.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необхо-

383

ГЛАВА 23

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ

АНТИАРИТМИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: член-корр. РАМН, проф. П.А. Галенко-Ярошевский;

д.м. н., проф. Н.В. Каверина; д. м. н., проф. А.Г. Камкин; к. б. н. А.И. Турилова;

к.м. н. С.К. Богус; д. м. н., проф. Ю.Р. Шейх-заде

Введение

Антиаритмические препараты — ЛС, проявляющие специфическую способность подавлять аномальный автоматизм, проводимость и возбудимость миокарда. Несмотря на наличие большого количества антиаритмических препаратов, поиск новых высокоэффективных и безопасных антиаритмических ЛС является одной из наиболее актуальных задач современной фармакологии. Это обусловлено тем, что используемые в медицинской практике антиаритмические ЛС обладают серьезными побочными эффектами и, в частности, проаритмическим действием. Современная классификация антиаритмических ЛС была предложена E.M. Vaughan Williams в 1969 году и в последующем модифицирована D.C. Harrison в 1979 году, а затем и другими исследователями. Она включает в себя пять классов: 1 класс — блокаторы натриевых каналов; 2 класс –β-адреноблокаторы; 3 класс — блокаторы калиевых каналов; 4 класс — блокаторы кальциевых каналов; 5 класс — специфические брадикардические средства, отрицательное хронотропное действие которых обусловлено их способностью блокировать f-каналы, встроенные в клеточную мембрану пейсмекерных клеток синуснопредсердного узла.

Поиск и доклиническое изучение потенциальных антиаритмических ЛС можно условно разделить на несколько этапов:

I этап – скрининг (первичный отбор и первичная оценка возможных механизмов действия соединений с потенциальной антиаритмической активностью).

На этом этапе поиска оценивают антиаритмическую активность соединений на моделях аритмий, вызванных химическими соединениями. Помимо этого, в рамках этих исследований на основании ЛД50 и ЭД50 определяют антиаритмический индекс (терапевтическую широту) изучаемых соединений. Как правило, скрининг проводят на нескольких моделях нарушений ритма сердца. Антиаритмический индекс изучаемых соединений сравнивают с аналогичными показателями известных антиаритмических ЛС.

По завершении I этапа исследований необходимо провести систематизированную оценку полученных результатов, отобрать наиболее перспективные соединения, после чего определить диапазон доз и схему изучения отобранного соединения на II-м этапе изучения.

II этап — изучение активности отобранных соединений на различных моделях нарушений сердечного ритма.

На этом этапе все исследования проводят на моделях:

—воспроизводящих наджелудочковые нарушения сердечного ритма;

—воспроизводящих желудочковые нарушения сердечного ритма;

—воспроизводящих реперфузионные нарушения сердечного ритма;

—воспроизводящих фибрилляцию различных отделов сердца.

385

Изучение эффективности изучаемых соединений проводится в сравнении с референтными антиаритмическими ЛС.

Поскольку антиаритмические ЛС часто используются у пациентов, страдающих коронарной болезнью сердца, в том числе острым коронарным синдромом, в завершение II этапа исследований необходимо оценить антиишемическую активность отобранных соединений.

По завершении исследований II этапа оценивают спектр антиаритмической активности отобранных соединений, определяют их эффективную дозу, оптимальные пути введения, разрабатывают принципиальную схему их применения в клинике. При проведении исследований II этапа обязательным является использование того способа введения соединений, который предполагается использовать при его клиническом изучении.

III этап – изучение электрофизиологических механизмов отобранных соединений в экспериментах in vivo и in vitro и особенностей их рецепторного действия.

1. Скрининг и первичная оценка возможных механизмов действия изучаемых соединений

Первый этап исследования начинают с определения ЛД50 изучаемого соединения. ЛД50 (при внутривенном введении) определяют на нелинейных крысах по общепринятой методике.

1.1. Исследование антиаритмической активности изучаемых соединений при нарушениях сердечного ритма периферического генеза

1.1.1. Исследование антиаритмической активности изучаемых соединений на аконитиновой модели нарушений сердечного ритма

Исследования проводят на нелинейных крысах-самцах массой 160–180 г.

Перед началом эксперимента у животных регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение). Затем подбирают дозу аконитина, которая во всех экспериментах вызывает смешанную предсердно-желудочковую экстрасистолию. Аконитин вводят в хвостовую вену в дозе 40–50 мкг/кг. Нарушения ритма сердца, как правило, начинают формироваться с первой-второй минуты после окончания введения аконитина. Регистрацию ЭКГ проводят через 3, 5, 10, 15 и 20 мин после введения аконитина. Изучаемое соединение вводят профилактически за 1–2 мин до введения аконитина. Эксперимент проводят по схеме контрольных исследований. Активность изучаемого соединения оценивают по его способности предотвращать нарушения ритма сердца, вызываемые аконитином.

Поскольку доза аконитина, вызывающая выраженные нарушения сердечного ритма, не стабильна и может у одной и той же группы животных варьировать в течение недели, контрольную серию и серию экспериментов по оценке эффективности одной дозы изучаемого соединения следует проводить в течение одного дня. По окончании экспериментов рассчитывают среднеэффективную дозу изучаемого соединения — ЭД50, т. е. дозу, которая у 50% животных предотвращает развитие нарушений ритма сердца. Обработку данных проводят по методу Литчфилда и Уилкоксона. Помимо этого, рассчитывают антиаритмический индекс (терапевтическую широту), т. е. отношение ЛД50 к ЭД50.

В основе аритмогенного действия аконитина лежит его способность нарушать функциональную активность быстрых трансмембранных потенциалзависимых натриевых каналов, поэтому эту модель рассматривают для оценки эффективности антиаритмиков 1 класса по классификации Е.М. Vaughan Williams. Имеются также данные о том, что определенный вклад в аритмогенное действие аконитина вносит его способность нарушать функциональную активность трансмембранных потенциалзависимых Са++ каналов L-типа. Поэтому в качестве референтных препаратов на этой модели аритмий используют антиаритмики I А класса (хинидин, новокаинамид), I В класса (лидокаин и др.) и антиаритмики I С класса (этмозин, этацизин и др.).

386

1.1.2. Исследование антиаритмической активности изучаемых соединений на хлоридкальциевой модели нарушений сердечного ритма

Высокие дозы кальция хлорида (250–300 мг/кг) вызывают у бодрствующих и наркотизированных нелинейных крыс-самцов (массой 200–250 г) тяжелые нарушения сердечного ритма, заканчивающиеся летальной фибрилляцией желудочков.

Перед началом эксперимента у животных регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение). Затем подбирают дозу кальция хлорида, которая во всех экспериментах вызывает фибрилляцию желудочков сердца. кальция хлорид вводят внутривенно в виде 10% раствора. Нарушения ритма сердца, как правило, начинают формироваться с 1-й мин после окончания внутривенного введения кальция хлорида. Регистрацию ЭКГ проводят через 5, 10, 15 и 20 мин после введения кальция хлорида. Изучаемое соединение вводят внутривенно за 1–2 мин до введения кальция хлорида. Эксперименты с изучаемым соединением сопоставляют с контрольными исследованиями.

По окончании экспериментов рассчитывают среднюю эффективную дозу изучаемого соединения и антиаритмический индекс.

Аритмогенная активность кальция хлорида связана с его способностью существенно повышать содержание ионов Са++ в кардиомиоцитах и тем самым вызывать их асинхронное возбуждение, а также в определенной мере нарушать процессы реактивации натриевых каналов, поэтому эту модель используют для оценки эффективности антиаритмиков IV, а также I класса по классификации Е.М. Vaughan Williams. В качестве референтных препаратов на этой модели аритмий используют антиаритмики IV класса (верапамил и др.) и антиаритмики I В класса (лидокаин и др.).

1.1.3. Исследование антиаритмической активности изучаемых соединений на адреналиновой модели нарушений сердечного ритма

1.1.3.1. Исследование антиаритмической активности изучаемых соединений в исследованиях на кошках

Эфирно-адреналиновую модель аритмии воспроизводят на кошках массой 2,5–3,5 кг. Животных наркотизируют внутрибрюшинным введением этаминал-натрия (нембутала) в дозе 40–50 мг/кг. Катетеризируют яремную вену для введения исследуемых веществ и сонную артерию для регистрации артериального давления. ЭКГ регистрируют во IIстандартном отведении. Исследуемое соединение вводят в 3 мл дистиллированной воды. После повторной записи ЭКГ адреналина гидрохлорид вводится внутривенно в дозе 20 мкг/кг одновременно с эфиром, который инстиллируется в трахею из расчета 0,1 мл/кг через катетер, введенный при помощи ларингоскопа. Последующие записи ЭКГ проводятся через 1, 3, 5, 10, 15, 30 и 50 мин. Антиаритмическую эффективность изучаемых соединений оценивают по их способности предупреждать гибель животных от фибрилляции желудочков. Учитывают процент выживших животных, а также отношение числа погибших животных к общему количеству.

1.1.3.2.Исследование эффективности изучаемых соединений

висследованиях на бодрствующих кроликах

Всвязи с тем, что одновременное использование двух и более аритмогенных факторов затрудняет интерпретацию полученных данных, рекомендуется использовать модель нарушений ритма сердца, вызванных адреналина гидрохлоридом у бодрствующих кроликов. Кроликов массой 2,5–3,5 кг фиксируют в специальном станке и регистрируют ЭКГ (II стандартное отведение). Затем в краевую вену уха вводят раствор 0,1% адреналина в дозах 120–150 мкг/кг. В течение 6–7 мин после внутривенного введения адреналина развивается политопная желудочковая экстрасистолия, однако

вряде случаев при использовании адреналина в дозе 150 мкг/кг развивается рефлекторная брадикардия и/или атриовентрикулярная блокада, которая через 2–3 мин

387

сменяется желудочковой экстрасистолией или желудочковой тахикардией. Через 30 мин после прекращения нарушений ритма сердца, внутривенно вводят изучаемое соединение в 1 мл растворителя, а затем через 2 мин аритмогенную дозу адреналина.

ЭКГ регистрируют через 1, 3, 5, 10, 15 и 20 мин после введения адреналина. Эффективность изучаемого соединения оценивают по его способности предотвращать желудочковые нарушения ритма сердца.

По окончании экспериментов рассчитывают среднеэффективную дозу изучаемого соединения и антиаритмический индекс.

1.1.3.3. Исследование антиаритмической активности изучаемых соединений в исследованиях на крысах и мышах

У наркотизированных животных (уретан 1,0–1,3 г/кг внутрибрюшинно) регистрируют ЭКГ во II стандартном отведении. Затем в вену хвоста вводят раствор адреналина гидрохлорида из расчета 100 мкг/кг. Мышам параллельно вводят в трахею 0,1 мл галотана. Через 1–2 мин развивается политопная желудочковая экстрасистолия, в большинстве случаев переходящая в фибрилляцию желудочков сердца. В тех случаях, когда при использовании данной дозы адреналина не удается достичь стойких нарушений сердечного ритма, дозу адреналина увеличивают до 100–110–120 и более мкг/кг. ЭКГ регистрируют через 1, 3, 5, 10, 15 и 20 мин после введения адреналина. Изучаемое соединение, приготовленное на физиологическом растворе, вводят за 1–2 мин до внутривенного введения и за 5–7 мин до внутрибрюшинного введения адреналина (крысам — в 0,3–0,5 мл растворителя, мышам — в 0,1–0,2 мл растворителя). Эффективность изучаемого соединения оценивают по его способности предотвращать желудочковые нарушения ритма сердца и/или гибель животных от фибрилляции.

Поскольку адреналиновая модель нарушений сердечного ритма у мелких животных, так же как и аконитиновая модель, достаточно сложно поддаетсяинтерпретации, эксперименты по изучению одной дозы изучаемого соединения следует проводить в течение одного дня. Адреналиновая модель нарушений ритма сердца воспроизводит аритмогенный эффект, вызванный повышением активности симпатической иннервации и содержания катехоламинов, в основе которых лежит опосредованная возбуждением b-адренорецепторов активация медленных трансмембранных кальциевых каналов L-типа, провоцирующая развитие эктопической активности водителей ритма 1-го, 2-го и 3-го порядка. Поэтому в качестве референтных препаратов на этой модели используют антиаритмики II класса (пропранолол, метопролол и др.) и IV класса (верапамил) по классификации Е.М. Vaughan Williams.

1.1.4. Исследование антиаритмической активности изучаемых соединений на хлоридбариевой модели нарушений сердечного ритма

Известно, что бария хлорид способен угнетать калиевую проводимость. В соответствии с этим, модель аритмии с использованием бария хлорида является адекватной для выявления веществ со свойствами III класса антиаритмического действия. Исследования проводят на бодрствующих кроликах массой 2,0–3,0 кг, в ушную вену которых вводят 2% раствор бария хлорида (3–4 мг/кг) и регистрируют ЭКГ путем наложения электродов на конечности. Для дальнейшего исследования отбирают только тех животных, у которых в течение каждой мин возникает не менее 1 экстрасистолы на протяжении 15 мин исследования. Через 5–7 дней животных снова берут в эксперимент и вводят ту же дозу бария хлорида, затем через 2 мин не более чем в 1 мл растворителя вводят изучаемое соединение. ЭКГ регистрируют во II стандартном отведении в течение 15 с со скоростью 50 мм/с. Определяют фон, после введения бария хлорида и через каждую минуту после инъецирования изучаемого соединения. Вслед за введением бария хлорида в дозе 3–4 мг/кг обычно развивается многофокальная аритмия, поэтому подбирают дозу исследуемого вещества, в которой оно уменьшает или полностью устраняет аритмию в течение 15 мин. Эффект изучаемого соединения вычисляют в процентах для каждой дозы.

388

Поскольку в основе нарушений ритма сердца, вызванных бария хлоридом, лежит блокада трансмембранных потенциалзависимых калиевых каналов, в качестве референтных препаратов используют антиаритмики III класса (амиодарон, дофетилид, соталол и др.).

1.1.5. Исследование антиаритмической активности изучаемых соединений на строфантиновой (оуабаиновой) модели нарушений сердечного ритма

Строфантиновую аритмию вызывают у наркотизированных уретаном (1,0–1,3 г/кг) морских свинок (самцы массой 300–400 г). Контрольным животным в яремную вену вводят раствор строфантина К в дозе 0,5 мг/кг. Через 1–2 мин развивается брадикардия и/или атриовентрикулярная блокада, сменяющаяся политопной желудочковой тахикардией, которая через 15–20 мин переходит в фибрилляцию желудочков сердца. Изучаемое соединение вводят внутривенно в 0,3–0,5 мл растворителя за 3–5 мин до введения строфантина К. ЭКГ регистрируют во II стандартном отведении каждые 2–5 мин после введения строфантина в течение 30 мин и более.

Аритмию можно вызывать также оуабаином (строфантином G). Оуабаин вводят наркотизированным эфиром морским свинкам в дозе 250 мг/кг. Изучаемое соединение вводят внутривенно за 2–3 мин до введения оуабаина. Эффективность соединений определяют по их способности предупреждать гибель морских свинок в процентах по отношению к гибели животных в контроле.

В качестве референтных препаратов на этой модели, как правило, используют антиаритмики IA и IВ класса. Для окончательного суждения о принадлежности нового соединения к определенному классу необходимо провести электрофизиологическое исследование.

По завершении I этапа исследования необходимо осуществить системный анализ полученных данных, оценить потенциальное сродство изучаемых соединений к тому или иному виду трансмембранных ионных каналов, отобрать наиболее эффективное (эффективные) из изучаемых соединений, определить дозы и схему проведения экспериментов, которые будут использованы на II этапе исследования.

2.Исследование активности

испектра антиаритмического действия соединений в модельных экспериментах

2.1.Исследование антиаритмической активности изучаемых соединений при нарушениях сердечного ритма периферического генеза

2.1.1.Исследование активности изучаемых соединений

на наджелудочковых моделях нарушений сердечного ритма

2.1.1.1. Исследование влияния изучаемых соединений на максимально воспроизводимую частоту предсердий в экспериментах in vitro [17]

Выделенное правое ушко предсердия кролика или морской свинки сразу же после экстирпации помещается в термостатируемую камеру с постоянно оксигенируемым раствором Рингера-Локка. Температура раствора 29–31 °С. Препарат подвешивают на специальном фиксирующем кронштейне. К ушку сердца подводят платиновые электроды для электрической стимуляции и регистрации частоты его сокращений. После 30-ми- нутной адаптации ушка его начинают стимулировать прямоугольными электрическими импульсами электрического тока длительностью 3–5 мс с постоянно нарастающей частотой. Параллельно с этим регистрируют частоту его сокращений. Частоту раздражения повышают до тех пор, пока не происходит «выпадение» очередного сокращения, т. е. до того момента, когда ушко перестает усваивать заданный ритм. Этот цикл возбуждения условно принимается за величину эффективного рефрактерного периода — ЭРП. Затем

389

ушку дают «отдохнуть» в течение 10–15 мин и в раствор вводят изучаемое соединение. Определяют количество изучаемого соединения, которое на 15% уменьшает максимально воспроизводимую частоту — ЭД15.

2.1.1.2. Исследование активности изучаемых соединений на модели трепетания предсердий [36]

Эксперименты проводятся на беспородных собаках обоего пола массой 10–15 кг. Собак наркотизируют (пентобарбитал натрия 40 мг/кг внутривенно или 50 мг/кг внутриплеврально) до IIIа уровня хирургического наркоза, после чего интубируют и переводят на искусственное дыхание кислородно-воздушной смесью в соотношении 1:1 (возможна вентиляция комнатным воздухом). Животных фиксируют на операционном столе в положении на левом боку. После торако- (по 3–4-му межреберью) и перикардотомии находят и выделяют сино-атриальный узел, располагающийся в месте соединения верхней полой вены и свободной стенки правого предсердия (сино-атриальный узел располагается под эпикардом в жировой ткани и имеет продолговатую форму; размер около 3–5 мм). Выделенный сино-атриальный узел разрушают (лучше путем термокоагулирования).

Вткань правого предсердия на расстоянии 0,5 см друг от друга вводят два позолоченных стимулирующих электрода и подшивают два электрода для регистрации электрограммы правого предсердия. Параллельно с этим регистрируют ЭКГ во II стандартном отведении.

После регистрации фоновой электрограммы правого предсердия и стандартной ЭКГ начинают постоянную стимуляцию правого предсердия прямоугольными электрическими импульсами длительностью 5 мс и исходной частотой 15–20 Гц. Через 1–10 мин, как правило, развивается трепетание предсердий. Если при этой частоте стимуляции трепетание предсердий не развивается, частоту стимуляции поступательно увеличивают до его развития. Через 30 мин после возникновения трепетания предсердий начинают инфузию изучаемого соединения. Эффективность изучаемого соединения оценивают методом «биологического титрования». Например, при проведении скрининговых экспериментов установлено, что эффективная доза изучаемого соединения составляет 1 мг/кг.

Вэтом случае изучаемое соединение вводят внутривенно с постоянной объемной скоростью в дозе 1 мг/кг/мин до полного прекращения трепетания предсердий. Определяют суммарную дозу, необходимую для купирования трепетания предсердий, и сравнивают ее с таковой для референтных препаратов.

Трепетание предсердий можно вызвать и аппликацией на правое предсердие аконитина хлорида или бария хлорида, однако следует учитывать, что в этом случае валидизация результатов существенно затруднена.

2.1.1.3. Исследование активности изучаемых соединений на модели нейрогенной фибрилляции предсердий

Исследования проводятся на кошках, находящихся под хлоралозо-этаминал- натриевым наркозом (75 и 15 мг/кг соответственно, внутрибрюшинно) при автоматическом поддержании температуры тела на уровне 37 ± 0,05 °С (с помощью аквариумного рефлектора мощностью 100–150 Вт, управляемого через ректально вводимый контактный термометр). Для исключения гипоксии, сильно влияющей на автоматию, возбудимость и сократимость миокарда, животное переводится на искусственную вентиляцию легких, для чего желательно использовать клапанное устройство, не обладающее мертвопространственным эффектом. После этого выделяют, лигируют и перерезают на уровне щитовидного хряща правый блуждающий нерв.

Периферический конец нерва накалывают на биполярные игольчатые электроды (изготавливаемые из инсулиновых инъекционных игл с межполюсным расстоянием 2,5–3 мм) и заливают расплавленной смесью медицинского воска и вазелинового масла, быстро отвердевающей при температуре тела (соотношение компонентов подбирается эмпирически).

390