3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

чавших исследуемое вещество, на 36%. На основании этих данных можем сделать вывод о том, что у животных с СД ЭЗВД снижена на 75%, а вещество № улучшает ЭФ у животных с экспериментальным СД на 67%.

Эндотелий независимая вазодилатация проверятся по реакции на нитроглицерин или нитропрусид натрия. Как правило, она у животных с экспериментальным СД не отличается от интактных животных, т.е. выраженность вазодилатации практически равная.

Изучение вазодилатирующей функции эндотелия при необходимости можно расширить, используя L-аргинин (воспроизводя «L-аргининовый парадокс»), а мощность NO-синтезирующей системы введением нитро-L-аргинина, или повторными введениями ацетилхолина в нарастающих дозах или через короткий интервал времени [16].

Антитромботическая функция эндотелия может оцениваться использованием тех же регистраторов кровотока в бедренной или сонной артерии при аппликации на стенку артерии 50% раствора хлорида железа, инициирующего развитие тромба в просвете сосуда и, в конечном, остановку кровотока. У интактных животных в сонной артерии, в указанных условиях, полная остановка кровотока происходит через 20–23 мин после аппликации хлорида железа, у животных с СД в среднем через 8 мин, с недостаточностью половых гормонов через 10–11 мин. Это свидетельствует о выраженной эндотелиальной дисфункции и значительном снижении антитромботической функции эндотелия у животных с СД. Общепризнано утверждение, что микроальбуминурия всегда связана с эндотелиальной дисфункцией. Исходя из этого, для оценки ЭДФ, а также нефропатии, может использоваться тест с микроальбуминурией.

Для оценки степени альбуминурии определяется содержание общего белка в суточной моче с использованием набора (Общий белок «Ольвекс Диагностикум» (с бромфеноловым синим), 200 мл). Принцип метода основан на том, что в результате взаимодействия белковых молекул с бромфеноловым синим в кислой среде образуется окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при длине волны 613 нм.

Влияние исследуемого вещества на липидный и углеводный обмен можно также изучить на животных с экспериментальным сахарным диабетом. Концентрацию общего холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ) определяют в сыворотке крови, а ХС липопротеидов высокой плотности — в супернатанте после преципитации ЛП, содержащих ЛП низкой и очень низкой плотности с использованием ферментативных колориметрических тестов «Ольвекс Диагностикум», и вычисляют значение концентрации ХС ЛПНП по формуле Фридвальда (1972) и индекс атерогенности по А.Н. Климову (1999).

Общий холестерин определяют с помощью стандартного биохимического набора (например: Холестерин общий, «Ольвекс Диагностикум», (фермент), 2×100 мл). Принцип метода основан на образовании окрашенного соединения (хинониминовый краситель); концентрация хининомина, определенная фотометрически при λ = 500 нм, пропорциональна концентрации общего холестерина в исследуемом образце.

Количественное определение глюкозы в крови и моче можно проводить ферментативным (глюкозооксидазным) методом с измерением величины оптической плотности надосадочной жидкости в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 500 нм на спектрофотометре с использованием наборов «Глюкоза ФКД» (Россия). В дальнейший эксперимент отбираются животные с уровнем сахара крови выше 12–15 ммоль/л, то есть крысы с развившимся сахарным диабетом.

2.2.5.Изучение влияния ФС на уровень катехоламинов

иактивность ренина в плазме крови

Для ответа на вопрос о нейро-гормональных сдвигах в организме экспериментальных животных, которые могут возникать под влиянием ФС, нет необходимости проводить специальные эксперименты. Кровь для биохимического определения ренина и катехоламинов может быть забрана у животных, используемых в других сериях исследований.

371

2.2.6.Влияние ФС на психоэмоциональное состояние

икогнитивную функцию

Выявление возможного влияния изучаемого ФС на психоэмоциональное состояние и когнитивную функцию выполняется с применением общепринятых методических подходов: изучение поведения животных в тестах:

—«открытое поле»;

—приподнятый крестообразный лабиринт;

—пассивного избегания с отрицательным (болевым) подкреплением (УРПИ);

—активное избегание с отрицательным (болевым) подкреплением (УРАИ);

—теста экстраполяционного избавления;

—подвешивания мышей за хвост.

При наличии анксиолитического действия можно добавить тест конфликтной ситуации по Vogel.

Результаты, полученные с помощью указанных тестов позволяют отметить наличие или отсутствие влияния изучаемого вещества на психо-эмоциональное состояние животных и их когнитивную функцию.

Предлагаемый комплекс методов позволяет ответить на все вопросы, поставленные перед фармакологом на втором этапе доклинических исследований нового вещества и является достаточным для оценки специфической активности новых антигипертензивных препаратов. Все эксперименты второго этапа исследований должны проводиться в одинаковом объеме для нового соединения и препарата сравнения.

При изучении ФС могут быть случаи, когда по механизму действия новое соединение не похоже ни на одно из классических гипотензивных средств, предлагаемых в качестве препарата сравнения. В таком случае экспериментатору предлагается провести дополнительные исследования с целью более полной характеристики препарата, а в качестве препарата сравнения выбрать препарат, который более других сходен с новым веществом по характреристикам антигипертензивного действия, влиянию на кровоснабжение жизненно важных органов и основные показатели кардио- и гемодинамики.

К дополнительным методам исследования могут быть отнесены следующие.

—Углубленное изучение психотропной активности, если она была выявлена на 2 этапе исследований (см. соответствующие главы настоящего руководства). Изучение влияния ФС на гладкие мышцы сосудов.

—Сравнительное изучение действия ФС на тонус резистивных и емкостных сосудов, на приток крови к сердцу.

В физиологической литературе признается значительная роль емкостных сосудов в формировании притока крови к сердцу и динамики сердечного выброса [14]. В последнее время показано, что емкостные сосуды играют важную роль в становлении гипертонической болезни; в частности, повышение тонуса емкостных сосудов в начальной стадии гипертонии ведет к увеличению притока крови к сердцу и повышению сердечного выброса.

Несмотря на важную функцию емкостного отдела в физиологии и патологии системы кровообращения, до сих пор мало изучено действие вазоактивных веществ на тонус венозных сосудов.

Методы исследования тонуса аккумулирующих сосудов у животных описаны [15]. Авторы подчеркивают, что основным параметром венозного отдела сосудистой системы является не венозное давление, которое не может характеризовать ни емкостной функции этих сосудов, ни активности их гладкомышечных образований, а объем крови, что и определяет необходимость изучения кровенаполнения венозных сосудов. Метод аккумулографии, предложенный Д.П. Дворецким (1967), позволяет одновременно судить об изменении тонуса резистивных и емкостных сосудов.

—Расширенное исследование эндотелиотропных эффектов, если они были выявлены на втором этапе (влияние ФС на пролиферативные и воспалительные процессы в сосудистой стенке, биохимические маркеры ЭФ/ЭДФ).

372

—Изучение влияния ФС на сократимость миокарда и функциональные резервы сердца.

Учитывая то, что при ГБ сердце работает с повышенной нагрузкой, миокард гипертрофируется, что первоначально повышает его резервы, а в последующем может вести

ких снижению, представляется практически важным дать оценку влияния ФС на инотропные резервы сердца. Исследование выполняется на гипертензивных крысах. Проводится курсовое лечение ФС до нормализации АД и затем еще 2 недели. После этого выполняется тест с физической нагрузкой «до предела». Сравнивая показатели пролеченных животных и животных контрольной группы с той же формой гипертензии, но не леченной, можно сделать вывод о повышении функциональных резервов сердца.

Более валидным подходом к оценке влияния ФС на инотропные резервы сердца является использование нагрузочных проб: нагрузки объемом, пробы на адренореактивность, максимальной изометрической нагрузки (подробное описание выполнения этих экспериментов представлено в данном руководстве в методических рекомендациях по доклиническому изучению эффективности ЛС для лечения заболеваний ССС).

—Изучение влияния на буферные сосудистые рефлексы в норме и в условиях эмоционально-болевого воздействия.

В поддержании нормального уровня системного АД важную роль играют буферные синокаротидные и артериальные рефлексы. Данные о влиянии вещества на функционирование прессорных и депрессорных каротидных рефлексов имеют теоретическое и практическое значение.

Исследования могут выполняться на наркотизированных животных (прессорный и депрессорный рефлекс в этих исследованиях воспроизводится обычным путем) и на животных в свободном поведении.

У животных в свободном поведении прессорный рефлекс можно получить кратковременным пережатием общей сонной артерии окклюдером любой конструкции. Большие трудности представляет воспроизведение депрессорного рефлекса. С этой целью используют лишь кардиохронотропный компонент барорефлекса при повышении АД на 30–40 мм рт. ст., вызванном введением мезатона или норадреналина.

—Влияние ФС на спонтанную и вызванную стимуляцией центральных структур или различных афферентов активность в преганглионарных (белая соединительная веточка) и постганглионарных (почечный и нижнесердечный нервы) волокнах симпатических нервов.

Исследования проводятся на наркотизированных животных с интактным мозгом, децеребрированных (межколликулярная перевязка) и спинальных (пересечение спинного мозга по С1 или С8) кошках. Спонтанная и вызванная активность в пре- и постганглионарных волокнах регистрируется обычным способом. Сосудистые прессорные и депрессорные реакции АД и электрофизиологические ответы в соответствующих нервах вызываются прямой и рефлекторной активацией продолговатого и спинного мозга.

Заключение

Рекомендованное комплексное исследование позволяет выявить ФС, которые по спектру и характеру своего действия могут быть предложены для КИ в качестве антигипертензивных средств.

Вместе с тем нужно иметь в виду, что в процессе доклинического изучения нового ФС может возникнуть необходимость проведения дополнительных исследований, направленных на более детальное изучение механизмов действия, имеющих важное значение для оптимизации клинического применения каждого из предложенных веществ. В данном случае перечень дополнительных методов исследования ФС может быть столь обширным, что экспериментатор должен сам решить, какие методы самые информативные с учетом специфических особенностей каждого соединения.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении

373

ГЛАВА 22

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ КАРДИОТОНИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: член-корр. РАМН, проф. И.Н. Тюренков; д. б. н. В.Н. Перфилова

Введение

Сердечная недостаточность (СН) — наиболее тяжелая сердечно-сосудистая патология, которая является следствием многих заболеваний: перенесенных инфаркта миокарда

иинфекций, врожденных или приобретенных пороков сердца, артериальной гипертонии, некоторых гормональных заболеваний, хронической алкоголизации и мн. др. СН характеризуется снижением сократимости миокарда и падением сердечного выброса, что ведет к ухудшению кровоснабжения жизненно важных органов. В свою очередь, нарушение кровоснабжения мозга, почек, сердца запускает целый каскад патофизиологических процессов, формируя порочный круг, ведущий к дальнейшему прогрессированию СН. Например, снижение кровоснабжения мозга ведет к активации симпатических центров и симпатической нервной системы (СНС), а последнее — к сужению резистивных и емкостных сосудов и к увеличению пред- и постнагрузки. Гипоксия почек приводит к усилению выработки ренина, что в сочетании с активацией СНС ведет к стимуляции всей системы ренин-ангиотензин-альдостерон (РААС). Повышенная активность РААС приводит к сужению резистивных и емкостных сосудов, задержке Na и воды в организме, централизации и увеличению объема циркулирующей крови, повышению пред- и постнагрузки. На определенном этапе развития СН сердце перестает справляться с возросшей нагрузкой

иперекачивать всю притекающую к нему кровь, в результате в полости сердца растут остаточный объем крови и конечно-диастолическое давление (КДД), дилатируются левый желудочек и левое предсердие, растет центральное венозное давление. Под влиянием СНС, РААС, а также вследствие гипоксии и растяжения устьев полых вен растет автоматизм синусового узла и, вследствие этого, увеличивается частота сердечных сокращений (ЧСС), сердце становится более чувствительным к действию аритмогенных факторов.

Повышенная пред- и постнагрузка, гипертрофированный миокард, высокая ЧСС и КДД ведут, с одной стороны, к повышению потребления сердцем кислорода, с другой, к снижению гемоперфузии сердца, что еще больше усугубляет гипоксию миокарда, при этом нарушаются процессы энергообразования с переходом метаболизма на энергетически менее выгодный анаэробный путь, сопровождающийся повышением в сердечной мышце лактата, возникновением ацидоза. В условиях сформировавшегося и прогрессирующего порочного круга нарастают явления сердечной недостаточности, снижения толерантности к физической нагрузке. Без фармакотерапевтической, а иногда и хирургической помощи больные обречены на преждевременную смерть. В распоряжении клиницистов для лечения СН имеются различные препараты, действие которых направлено на повышение сократимости миокарда (кардиотонические средства) и/или уменьшение нагрузки на сердце (ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, блокаторы ангиотензиновых рецепторов, b-адреноблокаторы, диуретики). В дополнение к указанным группам ЛС назначают и препараты, улучшающие обмен веществ в сердечной мышце, но они играют вспомогательную роль, и эффективность их оценивается невысоко.

375

Кардиотонические средства гликозидной и негликозидной природы являются базовыми средствами для лечения СН III и IV класса и острой сердечной недостаточности. К сожалению, все кардиотоники, применяющиеся в клинике, обладают малой широтой терапевтического действия, могут вызывать тяжелые осложнения вплоть до летальных, что ограничивает их широкое применение. Эти факты определяют актуальность и социальную значимость создания новых кардиотонических средств, которые бы отвечали ряду принципиальных требований — они должны:

—оказывать выраженное положительное инотропное действие без повышения потребления сердцем кислорода;

—не увеличивать общее периферическое сопротивление, частоту сердечных сокращений;

—не оказывать аритмогенного действия;

—снижать тонус СНС и ингибировать РААС;

—не задерживать Na и воду в организме, не вызывать гипокалиемию и гипомагние-

мию;

—быть совместимыми с другими препаратами, применяющимися для лечения СН;

—быть малотоксичными, иметь большую широту терапевтического действия;

—быть удобными в употреблении, действовать длительно.

1. Основные этапы исследования

I этап. Скрининг (первичный отбор) веществ с кардиотоническим действием in vitro на изолированных органах или in vivo с записью параметров, отражающих скорость сокращения и скорость расслабления миокарда. Анализ зависимости «доза (концен- трация)–эффект» определение наиболее эффективной дозы соединений, острой токсичности и широты терапевтического действия. Скрининг целесообразно проводить с использованием простых, легко воспроизводимых и экономичных методов, например, оценки параметров изометрического сокращения изолированных препаратов миокарда теплокровных животных или записи ВЖД, регистрации скорости выброса крови в восходящей аорте.

II этап. Изучение кардиотонической активности отобранных соединений на различных экспериментальных моделях острой и хронической сердечной недостаточности in vivo, влияние их на гемодинамику, метаболизм, обмен электролитов и др. в сравнении с эталонными препаратами. По завершении II этапа необходимо определить оптимальный путь введения и схему применения соединений.

III этап. Углубленное изучение кардиоваскулярного действия вещества:

—влияния на центральную гемодинамику в норме и при экспериментальной патоло-

гии;

—влияния на кровоснабжение жизненно важных органов (сердца, мозга, почек);

—влияния на изменение чувствительности сердца к действию аритмогенных факторов (химических, физических, нейро-вегетативных);

—влияния на потребление сердцем О2, утилизацию глюкозы, антиоксидантное действие, митохондриальное дыхание и окислительное фосфорилирование;

—влияния на агрегантные свойства крови и систему гемостаза.

2. Рекомендуемые тесты и биологические модели

Выбор тестов и моделей определяется задачами, стоящими перед исследователями, их обученностью и предпочтениями, имеющимися техническими возможностями. На I этапе необходимо получить ответ на вопрос: обладает ли вещество ино- и хронотропным действием? Для решения этой задачи могут быть использованы методы 1, 2, 4, 5. На II этапе нужно определить выраженность терапевтического действия с использованием моделей 1, 2, 3, показатели терапевтической эффективности, инотропного действия исследуемых соединений (изменения скорости сокращения и скорости расслабления мио-

376

карда), инотропные резервы, толерантность к физической нагрузке, насосную функцию, показатели центральной гемодинамики.

1.Метод оценки параметров изометрического сокращения изолированных препаратов сердца теплокровных животных (изолированные предсердия, папиллярные мышцы, трабекулы).

2.Метод изучения сократительной функции миокарда на препарате изолированного сердца, перфузируемого по Лангендорфу.

3.Модель сердечной недостаточности изолированных препаратов сердца, вызванная дефицитом кислорода.

4.Метод оценки сократительной активности миокарда путем катетеризации его полостей и записи внутрижелудочкового давления.

5.Метод изучения сократительной функции миокарда на основе анализа кривой фазового кровотока в восходящей части дуги аорты. Этот же метод позволяет определить насосную функцию сердца (УВ, МОК, а при регистрации АД рассчитать ОПСС).

6.Модель острой левожелудочковой недостаточности у собак.

7.Модели хронической сердечной недостаточности:

—дозированный надклапанный стеноз аорты (крысы, кролики, собаки);

—изадриновая интоксикация у крыс;

—экспериментальный инфаркт миокарда у крыс, мышей.

8. Метод определения функциональных резервов сердца с помощью нагрузочных тестов.

3. Условия проведения исследования

Действие фармакологического вещества может изменяться под влиянием ряда физиологических факторов: суточные и сезонные ритмы деятельности организма, температура, влажность, освещенность и кратность воздухообмена помещения, состав подстилок, загрязненность помещения ксенобиотиками и др. Содержание экспериментальных животных должно соответствовать действующим Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). В связи

сциркадными ритмами вводить фармакологические вещества в фиксированное время суток и указывать время года, когда проводились эксперименты. Существенное действие на чувствительность животных к фармакологическому веществу может оказать состав пищи. Рекомендуется давать животным стандартную пищу в соответствии с действующими нормами. Для питья мелких лабораторных животных целесообразно использовать автопоилки. Кормление следует производить в фиксированное время, т.к. прием пищи может изменить чувствительность животных к фармакологическому веществу. Наряду

сживотными, получающими исследуемые фармакологические вещества, в аналогичных условиях должны содержаться контрольные животные.

Кмоменту начала тестирования необходимо располагать сведениями о химической структуре вещества, его молекулярной массе, физических и физико-химических свойствах: растворимости в воде, жирах, летучести, степени раздробленности, степени электролитической диссоциации и т. д., так как действие лекарственных веществ может зависеть от их физических и физико-химических свойств, например, неполярные, гидрофобные соединения легко всасываются в ЖКТ и способны оказывать резорбтивное действие, большинство полярных веществ плохо всасывается в желудке и кишечнике, и поэтому использование их перорально может быть малоэффективно.

4. Оборудование, инструменты и реактивы

Для изучения инотропных эффектов исследуемых веществ на изолированных органах могут использоваться приборы, обеспечивающие, с одной стороны, оптимальное жизнеобеспечение органа (термостатируемые ванночки, необходимые питательные растворы), с другой стороны — чувствительную систему регистрации сокращений органа (изолирован-

377

ных предсердий, трабекул, папиллярных мышц). Для этого могут использоваться изометрические и изотонические датчики с механической записью на приборе с широким диапазоном усиления сигнала или с цифровой индикацией. Исследования, выполняемые на изолированных органах, позволяют в широком диапазоне установить зависимость «доза– эффект» (разведение 10-3–10-12), показать логарифмы «доза–эффект» — ЭК20, ЭК50, а используя агонисты и антагонисты различных типов рецепторов, установить возможный рецепторный или метаболический механизм кардиотропного действия.

Для регистрации ВЖД в исследованиях in vivo при катетеризации левого желудочка (лучше через сонную артерию вводить катетер непосредственно в левый желудочек без вскрытия грудной клетки и помимо записи ВЖД) можно проводить пробы с объемной нагрузкой и на адренореактивность, но нельзя выполнить тест с максимальной изометрической нагрузкой. Для проведения ее и теста навязанного ритма необходимо вскрывать грудную клетку и переводить животных на управляемое дыхание [19]. Для качественной регистрации ВЖД в этих исследованиях нужно использовать высокочувствительные датчики давления без или с очень малым объемом смещения (не более 0,01/ на 10 мм рт. ст. смещения). Чем мельче животное и выше ЧСС, тем выше требования к датчикам давления и системам регистрации.

5.Растворители и разбавители

Вкачестве растворителей могут быть использованы: дистиллированная вода, физ. р-р, ДМСО, спирт в низкой концентрации. В случае применения растворителей типа ДМСО, спирта, необходимо в контрольных исследованиях определить их кардиотропные эффекты. Повысить растворимость исследуемой субстанции может подогревание (но не кипячение!), размешивание при помощи магнитной мешалки.

6.Дозы, пути и режимы введения

Дозы тестируемого вещества нужно рассчитывать на единицу массы тела (мг/кг), если исследование выполняется in vivo, если in vitro — в концентрации 10-10–10-3.

Действие каждого фармакологического вещества зависит от дозы (или концентрации). Зависимость доза–эффект может носить линейный, S-образный, гиперболический или иной характер. Если опыты выполняются in vitro, кардиотропные эффекты веществ изучаются в разведениях от меньшей (10-10 до 10-3 моль/л). При сравнении двух одинаково действующих веществ сопоставляют их дозы, в которых вещества вызывают одинаковые по величине эффекты, и по этому показателю судят об активности веществ. Например, если вещество А увеличивает скорость сокращения на 20% в концентрации 10-9 моль/л, а вещество Б — в концентрации 10-7, считают, что вещество Б в 100 раз активнее вещества А. Если исследование выполнено in vivo, сравнение кардиотропного действия веществ производится по терапевтическому индексу.

Изучаемое вещество необходимо вводить тем способом, который предполагается использовать при клиническом применении. Пероральное (интрагастральное) введение испытуемых веществ проводится с помощью зонда. Внутривенное введение веществ осуществляется, чаще всего, в наружную яремную вену (или интраперитонеально).

7. Экспериментальные животные

При выборе вида лабораторных животных и методов изучения кардиотонического действия соединений необходимо стремиться к тому, чтобы патогенез моделируемых состояний был максимально близок к таковым у человека.

Для получения количественной характеристики специфической активности препарата обязательным условием является проведение исследований на достаточно большом количестве животных.

Для исследований кардиотонического действия веществ применяют здоровых половозрелых животных, прошедших карантин не менее 10–14 дней. Необходимо указать

378

питомник, из которого получены животные. Не контролируемыми питомниками пользоваться не следует. У животных разных видов активность фармакологических веществ может сильно отличаться, поэтому необходимо проводить исследования на нескольких видах животных, причем наряду с грызунами (мыши и крысы) обязательно использовать не грызунов (кошек, кроликов, собак). Исследования можно проводить как на нелинейных, так и на линейных животных. В последнем случае следует указать линию животных, поскольку чувствительность к фармакологическому веществу может меняться и внутри вида в зависимости от линии. Группы животных должны формироваться по возрасту, полу и массе. Эксперименты можно проводить на животных обоего пола с учетом полученных данных отдельно для самок и самцов. Следует указать возраст и пол животных, т.к. в зависимости от этого могут измениться фармакокинетика и активность фармакологического вещества. Разброс по исходной массе тела не должен превышать ±10%.

8. Критерии выбора препарата сравнения

Выбор препарата сравнения проводится в связи с задачами эксперимента. Эталоном может быть:

—препарат данного ряда (аналог исследуемого вещества по химической структуре), если он успешно применяется в клинике как кардиотоническое средство;

—препарат, сходный по механизму действия;

—наиболее эффективный по изучаемому (однонаправленному) профилю среди ЛП, применяемых в практике.

Одним из основных и принципиальных условий правомерности количественного сопоставления активности двух препаратов является параллелизм линий, выражающих зависимость между дозой введенного вещества и полученным эффектом («линии регрессии»).

9.Описание эксперимента и особенностей его проведения. Методические приемы, используемые для скрининга

идоклинического изучения кардиотонической активности соединений

9.1.Метод оценки параметров изометрического сокращения изолированных препаратов сердца животных

(изолированные предсердия, папиллярные мышцы, трабекулы)

Эксперименты проводятся на изолированных органах. Для получения препарата животных наркотизируют (эфир, фторотан, рауш-наркоз, уретан 400 мг/кг, хлоралоза, этаминал-натрия 30 мг/кг и др.), производят торакотомию, перкардотомию, извлекают сердце и помещают его в ванночку с оксигенируемым питательным раствором, охлажденным до 20 °С. Для скрининга веществ с кардиотоническим действием среди соединений стероидной структуры лучше использовать препараты, полученные из сердца морской свинки, для веществ нестероидной структуры — изолированные препараты (папиллярные мышцы, трабекулы, полоски желудочков и левого предсердия), сердец млекопитающих двух биологических видов (крысы, морские свинки, кролики, кошки) и изолированное сердце. Не используются препараты из правого предсердия, они обладают собственной ритмической активностью. Папиллярные мышцы у морских свинок выделяют из правого, у крыс — из левого, у кроликов и кошек — из обоих желудочков. Выделение и фиксация препарата должны осуществляться в течение 3–4 мин.

Затем препараты сердечной мышцы помещают в термостатируемую перфузионную камеру. Перфузию препаратов миокарда крыс осуществляют раствором Кребса при температуре +28–30 ± 0,5 °С, для препаратов сердца морских свинок используют раствор Тироде с температурой +30–34 °С. Скорость перфузии — 5 мл/мин. Раствор оксигенируют газовой смесью, содержащей 95% О2 и 5% СО2.Препарат одним концом крепится к неподвижному крючку, а другим жестко фиксируется к рычагу механоэлектрического пре-

379

образователя силы — механотрона. Силу (Fмакс) и напряжение покоя (То), развиваемые каждым препаратом и измеренные при помощи механотронов после усиления и дифференцирования записывают на регистрирующем приборе со скоростью не менее 100 мм/с. Препараты стимулируют прямоугольными импульсами длительностью 3–5 мс и амплитудой на 10—20% выше пороговой. Препарат «отмывают» 30–40 мин [5]. «Эталонными» веществами являются: изопротеренол (изадрин) — [1×10-8 М]; строфантин-G— [1×10-7 М], дофамин [1×10 -5 М]. Соединения, не реагирующие на «эталонные» препараты, в дальнейших исследованиях не используются. Изучаемое соединение добавляют в перфузионный раствор в концентрации 10-8М. Если в течение 10 мин оно не оказывает влияния на сократительные свойства изолированного препарата, добавляют раствор с концентрацией соединения на порядок выше (от 10-7 до 10-4М), каждый раз наблюдение длится 10 мин.

Активность исследуемых соединений оценивают при сопоставлении ЭК20 и ЭК50 (концентрация, увеличивающая Fмакс на 20 и 50%, соответственно) с таковыми «эталонных» препаратов. Статистическую обработку результатов проводят на основании данных не менее 8 экспериментов общепринятыми методами.

9.1.1. Определение избирательности инотропного действия соединений

Оценку влияния веществ на частоту сердечных сокращений проводят на спонтанно сокращающемся изолированном правом предсердии по вышеописанной методике. От-

ношение ЭК50инотр/ЭК50хрон, (ЭК50инотр — концентрация вещества, вызывающая увеличение Fмакс на 50%, а ЭК50хрон — концентрация вещества, вызывающая увеличение на 50% частоты сокращений изолированного правого предсердия). У соединения, обладающего

селективностью, отношение ЭК50инотр/ЭК50хрон должно быть менее 1.

9.1.2. Изучение кардиотонической активности соединений на препарате изолированного сердца

Эксперименты проводятся на изолированном по Лангендорфу сердце, перфузируемом в условиях постоянного давления и сокращающемся в спонтанном режиме. Сердце перфузируется раствором Креба-Хенселейта, pH 7,3–7,4, насыщенным карбогеном при t=37 °С.

Наркотизированным (этаминал-натрия 30 мг/кг с гепарином 5000 ЕД/кг) животным производят торакотомию и перикардотомию, отсекают сердце от удерживающих его сосудов и быстро помещают в сосуд с 0,9-процентным раствором NaCl, стоящий на льду. Вся процедура должна занимать не более 30 с (полная остановка сердца происходит через 30–40 с от момента вскрытия грудной клетки). Канюлируют через аорту сердце и легочную артерию и перфузируют с давлением на клапан аорты 18–20 см вод. ст. После стабилизации параметров сердца (через 20–30 мин) начинают регистрацию исследуемых параметров. Модель позволяет регистрировать частоту и силу сокращений сердца, параметры сократимости миокарда, коронарный кровоток, скорость потребления миокардам кислорода, измерять в перфузате концентрации кислорода, лактата, пирувата и др.

На этой и предыдущей моделях, используя агонисты и антагонисты различных типов рецепторов, блокаторы метаболизма и т. д., можно выявить некоторые механизмы кардиотропного действия изучаемых соединений.

По ЭК20 и ЭК50 (концентрация, увеличивающая Fмакс на 20 и 50%) судят об эффективности исследуемого вещества.

9.1.3. Модель сердечной недостаточности на изолированных органах

Исследование кардиотонического действия веществ на изолированных органах позволяет выявить интракардиальные механизмы реализации эффекта в отсутствие нейрогуморальных влияний.

380