124. Реакция иммунофлюоресценции (риф)

Принцип реакции заключается в том, что меченная флюорохромом иммунная противовидовая сыворотка соединяется со специфическим комплексом антиген — антитело, обусловливая его свечение при исследовании препарата в сине-фиолетовых лучах.

При проведении реакции пользуются люминесцентным микроскопом ДРШ-250 с иммерсионной системой.

В первой фазе реакции после добавления взвеси бледных трепонем к исследуемой сыворотке крови больного образуется комплекс антиген — антитело.

Во второй фазе происходит соединение меченной флюорохромом иммунной сыворотки! с образовавшимся комплексом антиген — антитело.

Методика. В сухую пробирку берут 5 мл крови из вены больного и инактивируют в термостате при температуре 56 °С в течение 30 мин. Из антигена (трепонемы кролика, аналогичные получаемым при РИБТ, см. № 123) готовят препараты на обезжиренных предметных стеклах. Для этого на одной стороне стекла карандашом рисуют окружность диаметром 1 см, а на другую наносят равномерно распределенную взвесь бледных трепонем, занимающую всю окружность. После высушивания на воздухе препарат в течение 10 мин фиксируют химически чистым ацетоном, нумеруют и затем готовят испытуемые сыворотки.

С целью получения различных разведений сыворотки больного берут три ряда пробирок: 1-й — цельная сыворотка, 2-й — 0,45 мл изотонического раствора натрия хлорида (9 капель), 3-й ряд — 6,95 мл изотонического раствора натрия хлорида (19 капель).

Из каждой пробирки 1-го ряда берут 0,05 мл сыворотки (1 капля) и переносят, хорошо перемешивая, в пробирки 2-го ряда, получая разведение 1 : 10, из каждой пробирки 2-го ряда переносят одну каплю (0,05 мл) в 3-й ряд, что соответствует разведению 1 : 200.

На предметные стекла с высушенным антигеном наносят по 1 капле сыворотки в разведениях 1 : 10 и 1 :200, препараты помещают во влажную камеру, которую закрывают крышкой и ставят в термостат на 30 мин при температуре 37 °С (1-я фаза реакции). Затем стекла извлекают из термостата, 2 раза осторожно промывают изотоническим раствором натрия хлорида, помещают на 10 мин в изотонический раствор натрия хлорида и высушивают. На стекла наносят по 1 капле флюоресцирующей сыворотки, помещают их на 30 мин во влажную камеру, снова 2 раза промывают изотоническим раствором натрия хлорида (2-я фаза реакции).

К готовому препарату добавляют 1 каплю забуферного глицерина, накрывают покровным стеклом, на которое наносят 1 каплю иммерсионного нелюминесцентного масла (диметилфталат).

Результаты реакции учитывают по степени свечения бледных трепонем. При отсутствии в испытуемой сыворотке антител свечения не наблюдается. Яркость свечения обозначают плюсами. При интенсивно свечении на темном поле видны ярко светящиеся бледные трепонемы желто-зеленого цвета (++++). если бледные трепонемы светятся не ярко, результат обозначают +++; при слабом свечении ++; при незначительном свечении (+) реакцию считают отрицательной; ++, +++, ++++ обозначаются реакции положительные, различной степени интенсивности.

РИФ 10 применяют при серодиагностике первичного серонегатив-ного сифилиса, когда все другие реакции (Вассермана, осадочные, РИБТ) отрицательные; РИФ 200 — для серодиагностики всех других форм сифилиса, включая и латентную.