4 курс / Дерматовенерология / Хламидийно_ассоциированные_инфекции_Хворик_Д_Ф_
.pdfбактерии, способные при определенных условиях не только поддерживать воспалительный процесс, но и вызывать гнойную деструкцию слизистых оболочек.
При рассмотрении этиологической структуры смешанного УГХ следует также учитывать, что при мочеполовых, желудочно-кишечных и генерализованных инфекциях различной природы мочевыводящие пути и прямая кишка являются источником разнообразных патогенных микроорганизмов, которые, выделяясь с мочой и калом, могут инфицировать УГТ. Наибольшее значение для современной дерматовенерологической, а также гинекологической практики имеет смешанная ХИ, возникающая при совместном инфицировании половых путей хламидиями и другими наиболее распространенными патогенными агентами, передающимися половым путем.
Анализ литературных данных и собственных наблюдений позволяет сделать заключение, что УГХ чаще всего бывает смешанным – с различными комбинациями сопутствующих микроорганизмов, обладающих разной степенью патогенности. При отсутствии других патогенных микроорганизмов эта инфекция в среднем наблюдается у 30% больных, но варьирует в различных группах популяции. При изучении смешанных инфекций важно не только устанавливать частоту сочетанного инфицирования мочеполовых органов С.trachomatis и другими микроорганизмами, но и выявлять характер взаимодействия этих агентов, способных влиять на развитие, течение и последствия заболевания, а также определять обоснованные меры терапии и профилактики.
31
Глава 3
ДИАГНОСТИКА УРОГЕНИТАЛЬНОГО ХЛАМИДИОЗА
Результаты лабораторных исследований в процессе лечения позволяют оценить адекватность проводимой терапии, а по ее окончании – полноту излечения. Вместе с тем, следует отметить, что на сегодняшний день не существует единого алгоритма и схемы диагностического обследования пациентов с подозрением на хламидиоз [239, 332].
Особенности хламидий свидетельствуют об их нетрадиционности в плане выявления классическими бактериологическими методами диагностики, а именно, данные микроорганизмы не растут на обычных питательных средах [201, 240, 246, 250, 333]. В этой связи для лабораторной диагностики УГХ в настоящее время используются основные четыре группы методов:
бактериоскопические (цитологические), с окраской мазка по Гименезу, Романовскому-Гимза, Макиавелли или раствором Люголя;
культуральные – выделение хламидий на клеточных линиях L-929, Mс Coy, Hela, куриных эмбрионах и др.;
иммунологические, основанные на выявлении антигенов (реакция иммунофлюоресценции) либо антител (ИФА)
С.trachomatis;
молекулярно-генетические (молекулярнобиологические), направленные на выявление нуклеиновых кислот С.trachomatis;
серологические методы выявления антител к С.trachomatis.
Достоверность лабораторной диагностики УГХ возрастает при одновременном использовании нескольких методов, особенно при обследовании пациентов с локализованными и системными формами инфекционного процесса [250, 253].
Первостепенное значение для диагностики хламидий имеет качество взятия и обработки материала от больных
[243].
32
На результатах диагностики сказываются количество взятых образцов, а также место, из которого они были получены. Наиболее информативным может быть клинический материал, если он получен при следующих условиях:
мазки взяты при наличии клинических признаков заболевания;
пациент не использовал лекарственные препараты для местного применения минимум в течение последних 48– 72 часов;
у женщин при исследовании материалов из УГТ взятие образцов желательно проводить приблизительно в середине менструального цикла (если заболевание не имеет явных проявлений) или в дни, когда нет кровянистых выделений (при обострении процесса);
у мужчин взятие образцов из уретры необходимо проводить при условии задержки мочеиспускания не менее 3
–4 часа;
пациент не принимал душ в течение 24 часов;
пациент не принимал антимикробные препараты в течение последних 3 – 4 недель.
Из-за возможной токсичности отобранного материала для диагностики имеют значение типы тампонов, с помощью которых берутся соскобы со слизистых. Так, было показано, что дакроновые тампоны лучше ватных, а их основа из пластика или металла лучше деревянной, причем, использование специальных щеточек особых преимуществ, в сравнении с дакроновыми тампонами, не дает. Особое значение имеет транспортировка образца в лабораторию и хранение этих образцов.
Перечень медицинских показаний для обследования на УГХ представлен в таблице 7 (согласно приложению №1 к приказу МЗ РБ № 486 от 20 мая 2009 г.).
33
Таблица 7 – Перечень медицинских показаний для обследования на ХИ
Показания |
Рекомендуемый |
|
вид исследований |
||
|
||
Мужчины |
|
Воспалительные заболевания половых путей |
МАНК |
(уретрит, эпидидимит, простатит, парауретрит, |
|
дизурия, кольцевидный баланит и баланопостит, |
|
деферентит, фуникулит, куперит; везикулит; кол- |
|
ликулит; проктит и/или проктоколит). |
|
Бесплодие, эпидидимит, орхит, орхоэпидидимит, |
МАНК |
простатит. |
|
Плановые оперативные вмешательства на органах |
МАНК |
мочеполовой системы. |
|
Воспалительные заболевания суставов. |
МАНК |
Длительно текущий конъюнктивит неустановлен- |
МАНК |
ной этиологии. |
|
Длительно текущий назофарингит неустановлен- |
МАНК |
ной этиологии. |
|
Женщины |
|
Воспалительные заболевания половых путей (вы- |
МАНК |
деления из мочеполовых органов; уретрит, вуль- |
|
вовагинит, цервицит, ВЗОМТ, бартолинит, пель- |
|
виоперитонит, посткоитальные или межменстру- |
|
альные кровянистые выделения из половых пу- |
|
тей, дизурия). |
|
Воспалительные заболевания малого таза, хрони- |
МАНК |
ческие боли в области малого таза, бесплодие. |
|
Женщины, которым ранее проводилось лечение |
МАНК |
влагалищной части шейки матки (консерватив- |
|
ное, хирургическое лечение) без предварительно- |
|
го углубленного обследования. |
|
Женщины с ранним сексуальным дебютом (до 17 |
МАНК |
лет). |
|
Перед проведением медицинских вмешательств: |
МАНК |
прерывание беременности, проведение репродук- |
|
тивных технологий (ЭКО, ИКСИ, инсеминация |
|
донорской спермой), проведение внутриматочных |
|
вмешательств, введение внутриматочных систем, |
|
плановыми операциями на органах мочеполовой |
|
системы. |
|
34
Женщины |
с |
отягощенным |
акушерско- |
МАНК |
гинекологическим анамнезом, планирующие бе- |
|
|||
ременность. |
|
|
|
|
Беременные женщины при постановке на учет. |
МАНК |
|||
Беременные с осложненным течением настоящей |
МАНК |
|||
беременности: кольпит, цистит, пиелонефрит, |
|
|||
кондиломатоз, угроза прерывания, истмико- |
|
|||
цервикальная недостаточность, хориоамнионит, |
|
|||
преждевременное излитие околоплодных вод. |
|
|||
Воспалительные заболевания суставов неуста- |
МАНК |
|||
новленной этиологии. |
|
|
||
Длительно текущий конъюнктивит неустановлен- |
МАНК |
|||
ной этиологии. |
|
|
|
|
Длительно текущий назофарингит неустановлен- |
МАНК |
|||
ной этиологии. |
|
|
|
|
|
|
Новорожденные |
|
|
Длительно текущий конъюнктивит неустановлен- |
МАНК |
|||
ной этиологии. |
|
|
|
|
Длительно текущий назофарингит неустановлен- |
МАНК |
|||
ной этиологии. |
|
|
|
|
Новорожденные с осложнением перинатального |
МАНК |
|||
периода: внутриутробная инфекция, конъюнкти- |
|
|||
вит, заболевания органов дыхания, заболевания |
|
|||
ЛОР-органов. |
|
|
|
|
|
|
Прочие контингенты |
|
|
Лица, предполагающие у себя наличие ХИ. |
МАНК |
|||
Лица, имевшие половой контакт с лицом с уста- |
МАНК |
|||
новленной ХИ. |
|
|
|
|
При обследовании на другие ИППП. |
|
МАНК |
||
Лица, подвергшиеся половому насилию. |
МАНК или куль- |
|||
|
|
|
|
тура клеток |
Группы риска: МСМ; лица, занимающиеся ком- |
МАНК |
|||
мерческим сексом. |
|
|
|
Хламидии являются «требовательными микроорганизмами» к соблюдению надлежащих условий их транспортировки (состав транспортной среды, температура, при которой осуществляется доставка и хранение материала, длительность транспортировки и хранения), поэтому условия транспортировки должны соблюдаться очень точно [247]. В случае несоблюдения правил взятия и условий доставки биологического материала образцы не подлежат исследованию; об этом
35
сообщается врачу, направившему биологический материал на исследование; разбитые стекла подлежат уничтожению. При взятии и транспортировке материала для проведения молеку- лярно-биологических и иммунологических методов исследования на С.trachomatis и использовании рекомендуемой для этого транспортной среды необходимо четко соблюдать инструкцию производителя применяемой тест-системы [246].
Далее приведена характеристика диагностических приемов, которые используются для диагностики УГХ.
Бактериоскопические (цитологические методы).
Методы цитологических исследований – микроскопическое исследование клинического материала. Соскобы со слизистых оболочек мочеиспускательного канала и шейки матки берут ложкой Фолькмана, специальной щеточкой или зондом, соблюдая правила антисептики. Выделения и слизистую пробку цервикального канала удаляют тампоном. Соскобы из глубины уретры и цервикального канала осуществляют со всех четырех квадрантов. В материале должны присутствовать эпителиальные клетки. Присутствие выделений и примесей крови маскирует хламидии и затрудняет диагностику. При экстрагенитальных поражениях соскобный материал получают аналогичным способом.
Наиболее распространенными методическими приемами являлась окраска препаратов из клинических материалов по Романовскому-Гимза, по Гименезу, окраска раствором Люголя, окраска по Макиавелли.
Для постановки предварительного диагноза УГХ достаточно обнаружить одно типичное цитоплазматическое включение. Метод прост в исполнении. Одновременно в препаратах можно оценивать морфофункциональное состояние лимфоцитов и нейтрофилов. Однако выявленные клеточные изменения могут служить лишь косвенным признаком наличия хламидий в материале. Необходимо помнить, что этот метод выявляет и псевдовключения (клеточные структуры и бактерии), напоминающие включения хламидий.
Чувствительность метода составляет 30% при конъюнктивитах, 10–20% – при УГХ, 15–20% – при пневмохламидиозах, 10–15% – при хламидиозах с поражением центральной нервной системы. Данный метод не пригоден для скрининговых исследований.
36
Методы выделения хламидий в культуре клеток. В
связи со сложным жизненным циклом C.trachomatis труднее поддается выделению по сравнению с большинством бактерий. Для того чтобы оптимизировать все этапы культурального метода, необходимо иметь тесные связи с сотрудниками лаборатории, выполняющими данное исследование: от взятия пробы, ее транспортировки (предпочтительно с помощью холодильной камеры) и последующего лабораторного исследования. Все вышеперечисленные факторы делают данный метод дорогостоящим, однако он имеет высокую чувствительность и специфичность. При этом специфичность может быть повышена увеличением кратности исследования.
Методика культуральной диагностики ХИ представлена в таблице 8 (согласно приложению №5 к приказу МЗ РБ № 486 от 20 мая 2009 г.).
Таблица 8 – Методика культуральной диагностики ХИ
Название |
|
Описание |
|
Принцип метода |
Метод основан на выделении |
культуры C. tra- |
|
|
chomatis с использованием специальных питатель- |
||
|
ных сред. |
|
|
Биологический |
1) |
соскоб из уретры; |
|
материал для |
2) |
соскоб из цервикального канала; |
|
исследования |
3) |
отделяемое из заднего свода влагалища; |
|
|
4) |
сперма; |
|
|
5) |
секрет предстательной железы; |
|
|
6) |
соскоб из конъюнктивы; |
|
|
7) |
соскоб из ротоглотки; |
|
|
8) |
синовиальная жидкость. |
|
Оборудование, |
1) |
камера Горяева; |
|
инструменты и |
2) |
светооптический микроскоп |
с иммерсионным |
материалы |
|
объективом; |
|
3)инвертный микроскоп;
4)стерильные пенфлаконы или культуральные панели;
5)водяная баня;
6)шейкер;
7)центрифуга с горизонтальным ротором;
8)эксикатор или СО2-инкубатор;
9)автоклав;
10)влажная камера или чашка Петри с увлажненным фильтром;
37
|
11) средства индивидуальной защиты персонала; |
|
12) предметные стекла; |
|
13) карандаш для маркировки стекол. |
Реагенты |
культура клеток McCoy; линии L-929, Hela и др. |
|
ростовая среда; |
|
0,02% раствор Версена; |
|
0,25% раствор трипсина; |
|
раствор трипанового синего; |
|
среда роста: среда Игла с 3% глютамина, содой, |
|
HEPES, 5–7% эмбриональной телячьей сыворотки |
|
(ЭТС) и гентамицином (20 мкг/мл); |
|
изолирующая среда: среда Игла с 3% глютамина, |
|
содой, HEPES, гентамицином (20 мкг/ мл), эмбрио- |
|
нальная телячья сыворотка (ЭТС) в количестве 10% |
|
от общего объема, 40% раствор глюкозы (1,25 мл |
|
на 100 мл среды); |
|
транспортная среда на основе сахарозо- |
|
фосфатного буфера; |
|
раствор Хенкса; |
|
метанол или формалин; |
|
дистиллированная вода; |
|
НСl для корректирования рН; |
|
изолирующая среда. |
Подготовка к |
Ведение культуры клеток |
проведению |
Для ведения культуры McCoy, L-929, Hela и др. ис- |
анализа |
пользуется ростовая среда. Пересев клеток прово- |
|
дится на 4-е сутки. |
|
Для более быстрого и полного снятия клеток со |
|
стекла к 0,02% раствору Версена добавляют 0,25% |
|
раствор трипсина в соотношении 2:1. |
|
Контроль качества культуры клеток проводится |
|
прижизненно под светооптическим микроскопом. |
|
В работу берутся клетки с отсутствием зернистости |
|
в цитоплазме и четкими границами. Подсчет клеток |
|
выполняют по общепринятой методике в камере |
|
Горяева с использованием трипанового синего. |
|
Приготовление клеточного монослоя. |
|
Суспензия клеток McCoy, линии L-929, Hela и др. в |
|
ростовой среде в концентрации 50–100 тыс/мл раз- |
|
ливается по 2 мл в стерильные пенфлаконы, содер- |
|
жащие на дне подложки (покровные стекла), или по |
|
1 мл – в лунки специальных 24-луночных культу- |
|
ральных панелей типа «Costar» с подложками или |
|
без них. |
38
|
Монослой на поверхности покровных стекол дол- |
|
жен стать слитным через 2 суток. Его следует оце- |
|
нивать в инвертном микроскопе. Нельзя работать с |
|
культурой, если среда мутная, щелочная или кон- |
|
таминирована. Следует подобрать концентрацию |
|
клеток таким образом, чтобы формирование моно- |
|
слоя происходило через 2 суток. Если крышки |
|
культуральных панелей не обеспечивают герме- |
|
тичность, культуру инкубируют во влажной атмо- |
|
сфере CO (около 5%) с тем чтобы регулировать рН. |
|
Клеточный монослой можно формировать непо- |
|
средственно на дне лунки панели. Отсутствие под- |
|
ложки увеличивает площадь монослоя, упрощает |
|
процесс его снятия при проведении пассажей. При |
|
наличии погружного объектива индикацию хлами- |
|
дий можно выполнять в лунках панелей. |
Процедура |
Образцы биологического материала, если они были |
анализа |
заморожены, оттаивают на водяной бане при 37°С. |
|
Во флаконы, содержащие клинический материал, |
|
добавляют по 2–3 мл изолирующей среды. |
|
Для придания образцам однородности их встряхи- |
|
вают на шейкере. |
|
Маркируют лунки панелей. |
|
Перед заражением из лунок с монослоем McCoy |
|
линии L-929, Hela и др. удаляют ростовую среду. |
|
Для повышения чувствительности культуры клеток |
|
к хламидиям можно проводить предварительную |
|
обработку клеток DEAE-декстраном. |
|
После удаления ростовой среды проводят инокуля- |
|
цию образцов и контролей на монослой в количе- |
|
стве 0,5 мл на лунку панели. Панель помещают в |
|
центрифугу с горизонтальным ротором и центри- |
|
фугируют при 2500–3000 оборотов течение 1 часа. |
|
Необходимая температура (33–35°С) в центрифуге |
|
обычно достигается от выделения тепла самим ее |
|
механизмом при такой скорости. Центрифуга мо- |
|
жет быть подогрета холостым ходом или обдувом |
|
горячим воздухом. |
|
После центрифугирования зараженную культуру на |
|
2 часа помещают в СO2 инкубатор (или эксикатор) |
|
при 37 °С. |
|
Удаляют инокулят, после чего в каждую лунку или |
|
флакон вносят по 1–2 мл изолирующей среды с |
|
циклогексимидом. Панели инкубируют в СO2- |
|
инкубаторе в течение 24–72 часов, а флаконы по- |
39
|
мещают в обычный термостат на этот же период. |
|
Исследование зараженной культуры проводится |
|
после 24-часового инкубирования при использова- |
|
нии иммунофлуоресцентного метода и спустя 48– |
|
72 часа при использовании окраски по Романов- |
|
скому – Гимза. |
Учет и оценка |
Оценка полученных результатов может проводить- |
результатов |
ся одним из следующих методов: окраска по Рома- |
|
новскому – Гимза. |
|
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием |
|
мазков разводят из расчета 1–2 капли красителя на |
|
1 мл дистиллированной воды. Мазки, фиксирован- |
|
ные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 |
|
мл готовой жидкой краски + 2 мл основного бу- |
|
ферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) |
|
в течение 40–120 мин. (продолжительность окра- |
|
шивания подбирают эмпирически) при 37°С во |
|
влажной камере (закрытая чашка Петри с увлаж- |
|
ненным фильтром на дне). После окрашивания |
|
мазки промывают в проточной воде и высушивают |
|
на воздухе. |
|
Препарат микроскопируют, начиная с малого уве- |
|
личения (объектив х10), затем переводят на боль- |
|
шое увеличение (объектив х40), затем используют |
|
иммерсию (объектив х100 иммерсионный), окуляр |
|
х7 или х10. |
|
При детекции с использованием окраски по Рома- |
|
новскому – Гимза в зараженной культуре выявля- |
|
ются включения элементарных телец хламидий в |
|
виде нескольких, обычно зернистых, микроколоний |
|
сине-фиолетового цвета; выявление хламидий с |
|
помощью иммунофлуоресцентного метода прово- |
|
дится согласно инструкции производителя к прила- |
|
гаемой тест-системе. |
Заключение ла- |
Возбудитель C.trachomatis, выявлен. |
бораторного ис- |
Возбудитель C.trachomatis, не выявлен. |
следования |
|
Контроль каче- |
На преаналитическом этапе оценивается: |
ства |
—взятие биологического материала в соответствии |
|
с требованиями; |
|
—выполнение требований хранения и доставки ма- |
|
териала в лабораторию; |
|
—выполнение требований маркировки проб и соот- |
|
ветствия маркировки пробы маркировке направле- |
|
ния; |
40