- •(Экспериментальное исследование)
- •Список сокращений и аббревиатур, использованных в работе
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы) 10
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 25
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма 55
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки 79
- •Введение
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы)
- •Проблема постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.1. Клинико-лабораторные проявления синдрома постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.2. Способы профилактики и коррекции гипоспленических послеоперационных расстройств
- •Ксенотрансплантация свиных органов и тканей
- •1.3. Технология получения материала для ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2. Характеристика методов исследования
- •2.2.1. Техника оперативных вмешательств
- •2.2.1.1. Ложная операция
- •2.2.1.2. Спленэктомия
- •2.2.1.3. Экстраперитонеальная аутотрансплантация селезенки
- •2.2.1.4. Ксенотрансплантация клеток селезенки
- •2.2.2.Приготовление препаратов для ксенотрансплантации
- •2.2.2.1. Получение взвеси клеток селезенки
- •2.2.2.2. Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.2.3 Ранотензиометрия
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3. Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.3.4 Иммунологические методы исследований
- •2.2.3.5 Общеклиническое исследование крови
- •2.2.3.6 Бактериологические методы исследований
- •2.2.4. Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология выделения клеток селезенки
- •3.1.1 Дезагрегация ткани селезенки
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Культивирование клеток селезенки новорожденной свиньи
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма
- •4.1 Развитие постспленэктомического гипоспленизма в ходе эксперимента
- •4.2 Летальность в экспериментальных группах
- •4.2.1. Патоморфологическое исследование погибших животных
- •4.3. Морфологическая оценка эффектов трансплантации ткани селезенки в условиях гипоспленизма
- •4.3.1 Исследование структуры печени
- •4.3.2.Исследование структуры легких
- •4.4. Морфологическое исследование зон трансплантации
- •4.5. Результаты ранотензиометрических исследований
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки
- •5.1. Лабораторная оценка раннего гепатопротекторного эффекта ксенотрансплантации культуры клеток селезенки
- •5.2. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на белково-синтетическую функцию печени в раннем послеоперационном периоде
- •5.3. Изменения неспецифической резистентности организма у аспленизизированных животных под воздействием ксенотрансплантации клеток селезенки в раннем послеоперационном периоде
- •5.4. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на систему гемостаза в раннем периоде после индукции гипоспленизма
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
Как известно из работы С.А. Лепеховой, снижение рН рабочих растворов ниже 7,2 (расчетная величина рН стандартных питательных сред RPMI, 199, Хенкса) после погружения в них взвеси выделенных клеток сопровождается уменьшением количества жизнеспособных клеток. В этой связи отдельная серия экспериментов in vitro была посвящена в нашей работе поиску оптимального pH среды для клеточной культивации.
Для выявления оптимального уровня pH нами были произведены 2 серии стендовых экспериментов, в которых производили инкубацию клеток селезенки свиньи в течение 2 часов в стандартных условиях. В процессе инкубации происходило изменение рН раствора в сторону закисления. После инкубации производили оценку степени жизнеспособности взвеси клеток свиной селезенки методом исключения красителя (0,4% раствор трипанового синего). Нами были получены следующие показатели жизнеспособности (табл. 3.2).
Таблица 3.2
Изменение рН питательной среды после размещения в ней выделенных клеток и показатель их жизнеспособности во взвеси после инкубации в термостате при 370С в течение 2 часов (медиана, нижний и верхний квартили)
Исходное значение рН питательной среды |
рН среды после размещения клеточной взвеси, n=8 |
Жизнеспособность, через 2 часа культивации, % |
6,8 |
6,6 (6,5-6,8) |
80,8 (79,3-80,9) |
7,0 |
6,9 (6,9-6,95) |
88,0 (87,7-88,1) |
7,2 |
6,95 (6,9-7,1) |
95,3 (95,3-96,2) |
7,4 |
7,2 (7,2-7,2) |
96,6 (96,6-97,7) |
7,6 |
7,4 (7,4-7,4) |
99,4 (99,4-99,6) |
7,8 |
7,6 (7,5-7,6) |
98,6 (98,2-99,1) |
8,0 |
7,0 (7,0-7,0) |
84,1 (84,0-84,2) |
8,2 |
6,7 (6,6-6,8) |
68,0 (66,6-69,1) |
Примечание: показатель жизнеспособности и объем внесенных клеток до инкубации был одинаковым во всех сериях наблюдений.
Следовательно, исходный показатель рН среды для культивации, с учетом закономерного закисления среды, должен составлять 7,6 (рац. предложение «Среда для культивации клеток селезенки свиньи» № 194 от 07.03.2001, принятое НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН).
Нами было показано снижение рН в среднем на 0,2 при исходных значениях 7,4-7,8, а при дальнейшем повышении рН питательной среды закисление ее после размещения клеток было более выраженным с существенным снижением удельного веса жизнеспособных клеток.
3.1.3 Культивирование клеток селезенки новорожденной свиньи
Применяли среду для культивации в оригинальной прописи (рац. предложение «Среда для культивации клеток селезенки свиньи» №194 от 07.03.2001, принятое НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН).
Среда для культивации клеток селезенки свиньи с pH раствора, равной 7,6.
Состав среды:
Среда RPMI 1640 - является основой
Трансферрин - 1мкг/мл
Глутамин - 0,3 мкг/мл
Дексаметазон Е-6 5Е/мл - 0,1 мл на 10 мл среды
Липиды бобов сои без холестерина - 17 мкг/мл
Сыворотка эмбриональная телячья кат. № К055 - 1 мл на 10 мл среды
рН среды - 7,6 (добивались титрованием стерильным 0,1% раствором NaOH, непосредственно перед применением).
Диспергирование клеточной взвеси проводили для снижения иммуногенности материала.
В процессе 5-ти суточной культивации количество выделенных клеток селезенки новорожденной свиньи увеличивалось на 50% (50,0-50,0). Длительность культивации была выбрана на основании известных данных о приобретении клетками в культуре к 5-м суткам культивации максимальной пролиферативной активности.
При цитологическом исследовании по окончании культивации (рис. 3.2) в препарате обнаруживали преимущественно ассоциации, состоящие из лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и ретикулярных клеток. Встречались и разрозненные клетки. Ядра всех клеток и цитоплазма имеют четкие контуры. В ядрах преимущественно крупноглобулярный хроматин, хорошо просматриваемый на фоне просветленного ядра. Апоптозных тел и сегментоядерных лейкоцитов нет.
Рис.3.2. Клетки селезенки новорожденной свиньи после культивирования в течение 5 суток. 1- группы клеток, состоящие из лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и ретикулярных клеток. Окраска по Романовскому. Об. 100х , Ок. 10х.
Таким образом, нами была получена культура клеток селезенки, состоящая преимущественно из лимфоцитов, с содержанием 4,6 (4,1-4,8) х 107 клеток в 1 мл взвеси и удельным весом жизнеспособных клеток 99,3% (98,9-99,4).
Если во взвеси выделенных из селезенки клеток их наибольшее количество было изолированным друг от друга – 95,0% (90-99%), то после культивации преобладали клеточные группы, а изолированных клеток было 45,0% (40-55%); pw=0,015. На этом основании в дальнейшем клеточный материал после выделения из селезенки комбинированным методом дезагрегации будем называть изолированными клетками селезенки (ИКС) и сравнивать эффекты их ксенотрансплантации (ОГ-2) с результатами пересадки культивированных клеток селезенки (ККС) – ОГ-1.
Обратимся теперь к результатам хранения клеточного материала.