30 Глава 1. Нуклеиновые кислоты. Строение и главные функции
других РНК в связи с тем, что кодирующие их гены имеют мозаичную струк туру, т. е. соответствующие последовательности дезоксирибонуклеотидов не являются непрерывными. Они могут содержать некоторые вставочные по следовательности, получившие название интронов. Кодирующие последова тельности, разделенные интронами, в этом случае называют экзонами. При транскрипции получаются РНК-предшественники (пре-РНК), содержащие и нужные в конечной (зрелой) молекуле РНК фрагменты, и лишние, которые должны быть удалены (вырезаны) из пре-РНК. Каждое вырезание должно сопровождаться воссоединением концов последовательных экзонов, между которыми находился интрон. Этот процесс получил название сплайсинг. При образовании мРНК сплайсинг происходит после образования кэпа и полиаденилирования (см. ниже).
При формировании подготовленной к трансляции мРНК с первичным транскриптом происходит несколько ферментативных превращений (рис. 5). Первым процессом является отщепление от находящегося на 5’-конце транс крипта трифосфатной группы одного остатка фосфорной кислоты, т. е. на 5’-конце образуется дифосфат (2). На следующей стадии остаток GMP от GTP (3) переносится на концевой дифосфат транскрипта с образованием ме жду ними остатка трифосфата, связанного по двум концам с 5’-ОН-группой гуанозина и концевым остатком транскрипта (4). Далее происходит метилиро вание N7 атома гуанина и метилирование одного или нескольких ОН-групп, примыкающих к 5’-концу транскрипта. Образование этой конструкции (кэпа, 5)
называют кэпированием.
После образования кэпа обычно происходит метилирование одной или нескольких 2’-ОН групп нуклеотидных остатков, примыкающих к кэпу.
Для окончательного формирования мРНК требуется еще одна модифика ция - присоединение к 3’-концевой ОН-группе транскрипта нескольких де сятков остатков (от 50 до 200) аденозин-5’-монофосфата (полиаденилированиё). Полиаденилирование, равно как и наличие кэпа, защищает транскрипт от действия внутриклеточных нуклеаз.
Вторая большая группа посттранскрипционных процессов представлена модификацией оснований, а в некоторых случаях также метилированием 2’-ОН группы рибозы, происходящей в основном в составе тРНК. Модифи цированные гетероциклы, представленные в каждой модифицированной РНК единичными звеньями или небольшим числом, называют минорными основа ниями. В табл. 2 приведены нуклеозиды, содержащие некоторые наиболее распространенные минорные основания. К их числу относят дигидроурацил, в котором гидрирована связь С5=С6 в урациле; тимин, характерный для ДНК, но изредка присутствующий вместо урацила также и в составе РНК; 4-тиоурацил, придающий чувствительность тРНК к УФ-облучению. Своеоб разную структуру имеет широко представленный в различных тРНК нуклеозид псевдоуридин, в котором урацил связан с рибозой не C-N, а С-С гликозидной связью с атомом Сб. Присутствие инозина в антикодоне тРНК влияет на специфичность взаимодействия тРНК и мРНК. Очень распространенной
§ 1.8. Посттранскрипционные и пострепдикационные превращения |
31 |
|
|
E-(CH2)4-NH3 + pppG |
|
рррХрХ........рХ-ОН |
^РРi |
|
’ ( |
|
|
E-(CH2)4-NH—pG |
|
|
ррХрХ........рХ-ОН |
|
|
2 |
3 |
|
GpppXpX........рХ-ОН + E-(CH2)4-NH3
+SAM
H3C о
О
II
о—р—°—CH2 <;t Дo Г
(X - нуклеозид)
A |
|
N NHz |
С Н 3 |
|
|
"о - р = о |
j T X |
i |
|
||
S+— С Н 2 |
q n Ado |
||||
о |
но он |
||||
"о—Р—о— сн2 в |
f H2 \ н |
|
|||
II |
. ^ |
I |
сн2 н |
Н |
|
о |
|
|
|||
|
О |
он |
h-c - nh2 он |
ОН |
|
|
I |
|
|||
|
|
|
СОО" |
|
|
|
|
|
S-аденозилметионин (SAM) |
||
|
"о—р—о -сн 2 |
в |
|
но он
Рис. 5. Образование кэпа на мРНК: 1 - мРНК с концевым трифосфатом; 2 - мРНК
сдифосфатом на конце; 3 - образование фермент-связанного GMP; 4 - перенос GMP на концевой дифосфат с высвобождением фермента; 5 - окончательный вид кэпа,
метилированного по N7 гуанина
модификацией оснований является метилирование различных атомов азота. В качестве одного из многочисленных примеров в табл. 2 приведен 2,2-ди- метилгуанозин.
32 |
Глава 1. Нуклеиновые кислоты. Строение и главные функции |
Таблица 2
Некоторые наиболеераспространенные модифицированные
нуклеозиды в составе тРНК
Название |
Структурная формула* |
Сокращенный |
||||
|
|
|
|
|
символ |
|
Дигидроуридин |
л . |
|
|
hU |
||
|
|
|
|
|||
|
у |
- . |
|
|
|
|
|
|
R |
|
|
|
|
Псевдоуридин |
" Л |
|
¥ |
|||
|
О |
|
||||
|
|
NH |
|
|
||
|
|
О |
|
|
|
|
Риботимидин |
Н зС У ^ М |
Н |
|
rT |
||
|
|
|
|
|||
|
|
l j ) |
^ 0 |
|
||
|
|
R |
|
|
|
|
4-тиоуридин |
Л: |
|
s4U |
|||
|
|
|
|
|||
|
|
R |
|
|
|
|
|
|
х |
|
|
|
|
Инозин |
N----- T i ' N H |
I |
||||
|
A |
j |
|
|||
|
|
|
|
|||
|
|
N |
|
|
|
|
|
R |
|
|
|
|
|
2,2-диметилгуанозин |
N -------- [ |
j ^ ^ H |
|
m22G |
||
^ |
N ^ N ( C H 3)2 |
|||||
|
|
R
*R - остаток рибозы.
Внастоящее время выявлено более 80 различных минорных оснований
всоставе тРНК из разных живых организмов. Все они естественно являются продуктами постгранскрипционной модификации продуктов транскрипции. Их функциональное значение выявлено лишь в отдельных случаях. Полную информацию о минорах в составе тРНК, их структурах и биологических ис точниках можно найти на сайте http//ma-mdb.cas.albany.edu/RNAmods.
Единственная функционально значимая модификация у эукариот ДНК (пострепликационная модификация) - это метилирование остатков цитозина
§ 1.8. Посттранскрипционные и постретикационные превращения |
33 |
по атому С5, которое происходит по самокомплементарным фрагментам CpG. Донором СНз-группы служит S-аденозилметионин. В ДНК генома встречаются участки, богатые фрагментами CpG (CpG-островки). Транскрипционно активны участки ДНК, у которых CpG не метилированы. Участ ки, богатые метилированными CpG, как правило, мало или вообще неактив ны. У бактерий пострепликативное метилирование может происходить также по экзоциклическим аминогруппам аденина (N6) и цитозина (N4). При реп ликации метилированные фрагменты расходятся по двум дочерним нитям, и образуется дуплексный фрагмент, в котором один из цитозинов метилиро ван, а второй нет. Специфичная к таким фрагментам метилаза метилирует второй цитозин, как показано на схеме.
сн3
|
5'(\АГ--- ------ |
C pG ------ |
— (ЛД/3' |
|
|
|
3.w ------------ |
G p C ------- |
--s/VTOg. |
|
|
|
|
СН3 |
|
|
|
|
|
репликация |
|
|
|
СНз |
—v/\A/3' |
|
|
|
|
-C p G - |
|
5' njxp---------- |
C p G ---------- |
3' |
|
-GpC- |
|
|
gi'w* 1 |
GpC " |
e |
|
|
|
-G p<f- |
|
|
|
|
|
|
CH3 |
|
SAM |
|
|
|
SAM |
|
сн3 |
|
|
|
CH3 |
|
------ C pG - |
■*/w3 |
|
---------- |
C pG |
|
3.ОАЛ- -epf- |
■ЛЛ- 5' |
|
y'W'------ |
QpC------ |
ЛЛg, |
СН3 |
|
|
|
C H3 |
|
Благодаря специфичности этой метилазы после репликации восстанавли ваются метилированные по обоим цитозинам CpG-фрагменты, но не проис ходит метилирование каких-либо дополнительных оснований, т. е. при раз множении сохраняется распределение метилированных цитозинов по ДНК (подобные распределения часто называют паттернами (от англ. pattern - вы кройка, узор).
34Глава 1. Нуклеиновые кислоты. Строение и главные функции
§1.9. Вирусы и инфекционные нуклеиновые кислоты
Помимо участия в описанных и ряде других процессов, связанных с функ ционированием клеток, нуклеиновые кислоты являются компонентами мно гочисленных вирусов. Вирусы представляют собой инфекционные частицы, содержащие нуклеиновую кислоту и некоторый набор белков. Таким обра зом, вирусы являются нуклеопротеидами. Попадая в определенные клетки хозяина, они размножаются, используя весь необходимый для этого биохи мический аппарат клетки. Вирусы чрезвычайно многообразны по принципам своего строения и механизму размножения. При этом носителем информации в зависимости от природы вируса могут быть как ДНК, так и РНК, причем существуют вирусы, содержащие однонитевую ДНК, а вирусные РНК вооб ще в большинстве случаев являются однонитевыми. Однако для их размно жения, которое может происходить только по принципу комплементарности, необходимо промежуточное образование комплементарной нуклеиновой ки слоты, программирующей синтез нуклеиновых кислот для новых вирусных частиц. В этом случае вирусную нуклеиновую кислоту квалифицируют как «плюс», а комплементарную ей промежуточную - как «минус» НК.
Кроме того, в состав зрелых вирусных частиц входят и белки, прежде все го белки оболочки вируса и белки-ферменты, необходимые для репликации вирусной нуклеиновой кислоты. Попадая в клетку, вирусы вносят в нее но вую информацию и переключают значительную часть внутриклеточного ме таболизма на воспроизводство новых молекул вирусной нуклеиновой кисло ты и на биосинтез белков, необходимых для формирования новых вирусных частиц (структурные белки) и промежуточных стадий этих процессов (не структурные белки). Например, в вирусе клещевого энцефалита носителем генетической информации является однонитевая вирусная РНК. При попада нии в инфицированную клетку эта РНК, работая первоначально как мРНК, программирует синтез неструктурного белка NS5, который далее катализиру ет синтез большого числа РНК-копий, комплементарных РНК вируса («ми нус-РНК»). Эта же РНК программирует синтез еще одного неструктурного белка NS3, который, используя информацию, содержащуюся в «минус-РНК», катализирует биосинтез большого числа молекул РНК, комплементарных «минус-РНК», т. е. идентичных исходной РНК («плюс-РНК»). Вместе с син тезируемыми параллельно структурными белками вируса они формируют внутри зараженной клетки большое число новых вирусных частиц, разру шающих в итоге клетку и способствующих распространению инфекции по организму.
Большое внимание исследователей привлекает, в частности, изучение ви руса иммунодефицита человека ВИЧ-1, который является носителем неизле чимой на данный момент болезни СПИД (синдром приобретенного иммуно дефицита человека). Этот вирус относится к группе ретровирусов. В состав вирусной частицы в качестве носителя информации входит вирусная РНК. Кроме того, помимо белков, формирующих вирусную частицу, в нее входит
§ 1.9. Вирусы и инфекционные нуклеиновые кислоты |
35 |
молекула фермента обратной транскриптазы. Это фермент катализирует на первой стадии инфекции синтез молекул ДНК - комплементарных копий ви русной РНК (кДНК, применительно к вирусам их обычно называют «минус» ДНК). После этого образовавшиеся «минус» ДНК кодируют синтез (при по мощи того же фермента) комплементарных ей «плюс» ДНК, в результате че го образуются двунитевые ДНК, содержащие последовательности, воспроиз водящие последовательность нуклеотидов вирусной РНК, но построенные из дезоксирибонуклеотидов. С помощью специального, кодируемого вирусной РНК белка интегразы двунитевые ДНК встраиваются в геном человека и да лее, используя аппарат транскрипции и трансляции клетки, воспроизводят большое число молекул вирусной РНК и структурных белков вируса, созда вая условия для формирования в зараженной клетке большого числа новых вирусных частиц.
Значительное число вирусов размножаются в бактериях. В этом случае их называют бактериофагами, или просто фагами. Среди них наиболее деталь но изучаются и используются фаги Т4 и Т7. У самого большого из фагов этой группы, Т4, содержащего более сотни генов, запрограммирован синтез ряда ферментов, значение которых для жизнедеятельности самого фага не вполне понятно. Некоторые его ферменты нашли широкое применение в качестве инструмента биохимических исследований, например, программируемый ДНК фага Т4 фермент полинуклеотидкиназа, который катализирует присое динение фосфата к 5’-концу полинуклеотидов. Донором фосфата в этом слу чае служит у-фосфат молекулы АТР. Если последняя содержит высокомече ный у-фосфат, то тем самым появляется возможность ввести радиоактивную метку в 5’-конец полинуклеотида, что широко используется при установле нии первичной структуры и химической модификации нуклеиновых кислот. Бактериофаг Т7 содержит программу для синтеза специальной РНКполимеразы, которая обладает высокой эффективностью в синтезе РНК, при чем при наличии в составе ДНК, содержащей интересующий исследователя ген, позволяет получать на каждую транскрибируемую нить такой ДНК мно гие сотни РНК-транскриптов. В то же время среди вирусов встречаются и та кие, у которых наследственная программа представлена однонитевой ДНК.
В природе существуют также инфекционные частицы, состоящие только из однонитевых молекул РНК - вироиды и вирусоиды. Первые обладают спо собностью размножаться внутри клетки, т. е. инфекционны сами по себе, вто рые размножаются лишь в присутствии специальных вирусов-помощников. В обоих случаях сами инфекционные частицы представляют собой «плюс» РНК, а комплементарные им промежуточные, необходимые для их реплика ции, - «минус» РНК.
Глава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот
§2.1. Нуклеотиды
2.1.1.Негенетические нуклеозид-5’-трифосфаты. Нуклеозидциклофос-
фаты
В § 1.1 введено понятие о нуклеотидах как нуклеозид-5 ’-фосфатах, яв ляющихся структурными единицами нуклеиновых кислот. Было также сказа но, что при биосинтезе нуклеиновых кислот мономерами являются не моно фосфаты нуклеозидов, а нуклеозид-5’-трифосфаты, у которых с 5’-ОН груп пой пентозы связано три остатка фосфорной кислоты.
Помимо участия в качестве мономеров, в биосинтезе нуклеиновых кислот NTP выполняют другие важные биохимические функции. Так, UTP и GTP являются участниками биосинтеза олиго- и полисахаридов, а СТР участвует в биосинтезе фосфолипидов.
Важнейшим участником огромного числа биохимических процессов яв ляется АТР - основной аккумулятор энергии в живой природе. Подавляющее число биохимических процессов, идущих с повышением свободной энергии Гиббса AG, протекает сопряженно с гидролизом одной из пирофосфатных связей
в АТР. Гидролиз пирофосфатной связи между а- и (3-фосфатами происходит
сAG0 - -31,8 кДж/моль, а между Р- и у-фосфатами с AG0 - -31,0 кДж/моль. Кроме того, АТР является донором фосфата в многочисленных биохимиче ских реакциях фосфорилирования. Например, превращение глюкозы в глю-
козо-6-фосфат имеет AG°’= -13,8 кДж/моль, т. е. реакция фосфорилирования глюкозы с помощью АТР характеризуется значением AG0’ = -18,0 кДж/моль. Систематически эти процессы рассматриваются в курсах биологической химии.
Остаток фосфорной кислоты может быть связан одновременно с двумя ОН-группами. Такие нуклеотиды называют нуклеозидциклофосфатами. На пример, при действии ряда химических реагентов, способствующих образо ванию фосфоэфирных связей, на нуклеозид-3’-фосфаты легко получается связь с соседней 2’-ОН группой с образованием нуклеозид-2’,3’- циклофосфатов. В этом случае используют обозначение циклофосфатного фрагмента в виде символа >. Например, уридин-2’,3’-циклофосфат обозна чают как U > р.
§ 2.1. Нуклеотиды |
37 |
О
нуклеозид-2',3'-циклофосфат U>p
Гуанозин-3’,5 ’-циклофосфат и аденозин-3\5 ’-циклофосфат участвуют в регуляции большого числа биохимических процессов (§ 17.1).
о- |
СГ |
2.1.2. Конформация полинуклеотидной цепи. Взаимная ориентация пентозного гетероцикла в нуклеиновых кислотах
Биологическое функционирование белков и нуклеиновых кислот нераз рывно связано с их пространственной структурой. Геометрия любой молеку лы определяется тремя группами геометрических характеристик ее химиче ских связей - длинами всех ковалентных связей, углами между связями, об разуемыми каждым из атомов молекулы, и торсионными углами между свя зями, примыкающими к соседним атомам. Первые две группы характеристик для атомов лежат в достаточно узких пределах и сравнительно мало влияют на геометрию молекулы в целом. Поэтому геометрия макромолекулы в ос новном определяется торсионными углами между атомами остова молекулы. Эти углы определяют взаимное расположение в пространстве четырех сосед них атомов А, В, С и D. Схема определения понятия торсионного угла приве дена в приложении.
При описании истинной конформации нуклеиновых кислот и их компо нентов в свободном виде и в составе нуклеиновых кислот возникает три главных вопроса. Первый - это конформация рибозофосфатного остова (кон формация полинуклеотидной цепи), состоящего из периодически повторяю щихся атомов Р, 0-5’, С-5’, С-4’, С-3’, 0-3’ Она описывается шестью торси онными углами - а, р, у, 8, е, г|, характеризующими повороты вокруг шести
38 Глава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот
повторяющихся связей: Р - 0-5’, 0-5’ - С-5’, С-5’ - С-4’, С-4’ - С-3’, С-3’ - 0-3’ и 0-3’ - Р (рис. 6).
Р
I
Рис. 6. Торсионные углы в полинуклеотидной цепи
Именно эти углы определяют общий ход полинуклеотидной цепи. Сама по себе полинуклеотидная цепь не имеет какой-либо резко предпочтительной конформации, и последняя в основном определяется взаимодействиями меж ду гетероциклическими основаниями. Эти взаимодействия и вытекающие последствия для пространственной структуры нуклеиновых кислот рассмат риваются в гл. 5.
Два других вопроса - это конформация нуклеотидов и нуклеотидных звеньев в составе нуклеиновых кислот. Это, во-первых, конформация угле водного фрагмента. Он является общим для нуклеотидов и углеводов и по этому рассматривается в гл. 13, посвященной биоорганической химии угле водов. Во-вторых, это взаимная ориентация углеводного звена и гетероцик лического основания.
Взаимная ориентация фуранозного цикла и гетероциклического основа ния определяется торсионным углом, описывающим поворот гетероцикла вокруг гликозидной связи (конформация по гликозидной связи).
Этот угол, обозначаемый х> определяется как угол для системы атомов 0-4’ - С-1 ’ - N1 - С2 у пиримидиновых и 0-4’ - С-1 ’ - N9 - С4 у пуриновых нуклеотидов. Для качественного рассмотрения можно в грубом приближении представить себе, что средняя плоскость фуранозного цикла и плоскость ге тероцикла взаимно перпендикулярны. Торсионный угол %определяет, какая часть гетероцикла оказывается над плоскостью фуранозного кольца, а какая соответственно повернута в сторону от кольца. Две стороны гетероциклов, как в случае пуринов, так и в случае пиримидинов, неэквивалентны. Наибо лее близкими к плоскости, характеризующей расположение фуранозного цикла в случае пиримидиновых гетероциклов тимина, урацила и цитозина, являются группа С6 -Н6 . Группа С2-02 существенно более объемная и к тому же полярная. В случае пуриновых гетероциклов - аденина и гуанина - бли
§ 2.1. Нуклеотиды |
39 |
жайшими к той же плоскости оказываются группа С8-Н8 и существенно бо лее объемистый фрагмент C4-N3-C2 (рис. 7).
|
|
|
н |
|
Н0 'СН2 |
w р |
но- -сн.2 |
H.r ^C. |
NH2 |
\ ] Н Ч |
V |
и |
|
|
^V Nи |
|
|
C - N |
I T |
NHo |
1 7 о |
он он |
|
он он |
HVv
HO"CH2 |
оI z/N |
НО'СН2 |
.У . " .\ С^ И 2 |
он он |
|
он он |
|
Рис. 7. Ориентация гетероцикла относительно фуранозного цикла: а - анти- конформация; б - син-конформация
Конформации, при которых более объемистый фрагмент повернут в на правлении от фуранозного кольца, называют анти-конформациями. В боль шинстве случаев в составе нуклеиновых кислот анти-конформации являются предпочтительными. В противоположной ситуации, когда над фуранозным кольцом располагается фрагмент С2-02 пиримидина или шестичленный цикл пуриновой системы, конформации называются син-конформациями.
Предпочтительность антии-конформации не является абсолютной. В сле дующей главе будут описаны случаи, когда в нуклеиновых кислотах гуанозин находится в син-конформации. Кроме того, последняя оказывается пред почтительной у модифицированных оснований, если в положение 6 пирими дина или положение 8 пурина вводятся объёмистые заместители, например, метальная группа или атом брома.
2.1.3. Спектральные характеристики нуклеозидов и нуклеотидов
Гетероциклические основания, а также нуклеиновые кислоты и их компо ненты обладают характерными спектрами поглощения в ближней ультрафио летовой области спектра. Каждый нуклеозид и нуклеотид в зависимости от входящего в его структуру основания имеет характерный спектр в области 220-280 нм. В табл. 3 приведены длины волн в максимуме и минимуме по