200 |
Глава 9. Пространственная структура белков |
присутствующих в исследуемых белках. Для выбора этих реагентов полезно предварительно иметь сведения об аминокислотном составе белков, форми рующих изучаемый комплекс. Выбранные группы соединяются с помощью специального связующего их спейсера {линкера).
Для изучения нуклеопротеидов используются реагенты, у которых одна из групп реакционноспособна к каким-либо боковым радикалам аминокис лотных остатков, а другая - к боковым радикалам нуклеотидов. Образовав шиеся при действии бифункциональных реагентов продукты сшивки могут быть разделены с помощью хроматографии или электрофореза.
Первоочередной задачей после их выделения является выяснение, какие именно компоненты комплекса оказались сшитыми. Каждый из компонентов комплекса в используемой системе разделения имеет определенное положе ние, которое позволяет его идентифицировать. Однако, будучи сшитым с по мощью бифункционального реагента с каким-либо другим макромолекулярным компонентом комплекса, он, естественно, займет в этой системе разде ления совершенно другое положение. Поэтому особенно перспективным яв ляется использование таких бифункциональных реагентов, содержащие на ряду с наличием двух реакционноспособных групп группу (функцию), по ко торой после выделения можно расщепить линкер, после чего сшитые компо ненты могут быть разделены. В используемой для разделения системе они займут положение, близкое к положению исходных компонентов, от которых они отличаются лишь небольшими дополнительными остатками при моди фицированных аминокислотах в составе биополимеров. Такие реагенты на зываются полифункциональными.
В качестве конкретного примера использования подобного типа реаген тов можно привести широко применяемый для этих целей иминотиолан, взаимодействующий с остатками лизина и вводящий в модифицируемые бел ки остатки SH. Последующее окисление приводит к образованию S-S-мости- ков между сшитыми белками. После выделения сшитых белков мостики мо гут быть легко разрушены с образованием белков, которые отличаются от сшиваемых белков всего лишь наличием небольших дополнительных остат ков HS-(CH2)3-C=NH:
Белок 1 — (СН 2) — NH2 |
|
H2N -(C H 2)4— Белок 2 |
|
|
|
+ |
NH |
Белок 1 - ( C H 2)— N H - C - ( C H 2)3- S H |
+ |
HS — (CH2)r |
C - N H - (C H 2) — Белок 2 |
NH |
|
окисление |
NH |
|
|
|
|
Белок 1 — (CH2)4— N H — C - (C H 2)3- S — S — ( C H ^ - C - N H - ^ H ^ — - Белок 2 |
|||
II |
|
NH |
|
NH |
|
|
§ 9.2. Белки, состоящие из нескольких полипептидных цепей |
201 |
Такая же методология используется и для изучения организации нуклеопротеидов, к числу которых относятся рибосомы, нуклеосомы и вирусы. В этом случае целесообразно использовать такие бифункциональные реаген ты, у которых одна из реакционноспособных групп реагирует преимущест венно с какими-либо аминокислотными остатками, а другая - с остатками нуклеотидов.
В качестве реакционноспособных групп бифункциональных реагентов нашли применение имидоэфирные группы, реагирующие с 8-аминогруппами остатков лизина; эпоксигруппы, реагирующие с атомами N7 остатков гуани на, e-аминогруппами остатков лизина и SH-группами остатков цистеина; диаминодихлорплатина, образующая координационные соединения с остат ками серусодержащих аминокислот, имидазольным кольцом остатков гисти дина и атомами N7 остатков гуанина; азиридиновое кольцо, образующее при облучении радикалы карбена; азидогруппы, образующие при облучении ра дикалы нитрена, и многие другие.
В табл. 14 приведены некоторые бифункциональные реагенты с расщеп ляемыми спейсерами, которые использовались для изучения четвертичной структуры бактериальных рибосом и их субъединиц. В качестве расщепляе мых в приведенной таблице показаны спейсеры с S-S-фрагментами, которые легко разрушаются окислением или обработкой тиолами; с диэпоксигруппа ми, которые после алкилирования превращаются в г/мс-диольные, расщеп ляемые окислением перйодатом, омыляемыми сложноэфирными группами - С(0)0-. Сшивка диаминодихлорплатиной может быть разрушена добавлени ем тиомочевины.
Таблица 14 Структурные формулы некоторых бифункциональных реагентов
Название |
Структурная формула |
Реагирующие группы в |
||||
реагента |
|
|
|
|
|
белках и РНК |
2-иминотиолан |
|
|
|
|
NH |
8-аминогруппы остатков |
|
|
|
|
|
лизина |
|
диэпоксибутан |
СН,--- СН — СН — СН, |
атомы N7 остатков гуанина, |
||||
s-аминогруппы остатков |
||||||
|
|
|
|
\ |
/ |
лизина, SH-группы остатков |
|
HoN |
|
' |
, Cl |
цистеина |
|
транс- |
\ |
S-атомы остатков цистеина |
||||
дихлордиами- |
|
Pt |
/ |
|
и метионина, имидазольные |
|
ноплатина (II) |
|
/ |
\ |
|
кольца остатков гистидина, |
|
|
|
nh2 |
||||
|
Cl |
|
|
атомы N7 остатков гуанина |
||
|
О |
ОН |
ОН |
О |
8-аминогруппы остатков |
|
тартилдиазид |
II |
|
1 |
1 |
II |
лизина |
N3-C-CH-CH—C-N3 |
202
диметил-3,3- дитиобис(пропионимидат) дигид рохлорид
азиридин
Глава 9. Пространственная структура белков
Окончание табл. 14
О |
|
^ H ^ H C I |
s-аминогруппы остатков |
|
|
|
|||
СН з-С |
S -(C H 2)2- C 4 |
лизина |
||
;с-(сн2)24 |
г сНз |
|||
|
||||
HCI* HN |
|
О |
|
все остатки, способные реа
гировать с карбеном
F> ^ O - ° - 0
О
Основные данные о третичных и четвертичных структурах макромоле кул, а также о структуре их комплексов с малыми молекулами накапливают ся в банке данных PDB. Об этом детально будет рассказано в гл. 20, посвя щенной биоинформатике.
Глава 10. Химический синтез пептидов и белков
§ 10.1. Общие проблемы химического синтеза полипептидов
Пептидная связь образуется при взаимодействии N-компонента, являю щегося донором амидной группы, и С-компонента - донора карбонильной группы. Для химического синтеза полипептида длиной п аминокислотных остатков необходимо образовать п-1 пептидную связь. Как и при синтезе олиго- и полинуклеотидов, это может быть достигнуто либо блочным методом путем синтеза нескольких более коротких пептидов и их последующим со единением, либо ступенчатым наращиванием растущей полипептидной це-пи аминоацильными остатками с N- или С-конца. В настоящее время преимуще ственно используется ступенчатый синтез с наращиванием цепи с N-конца.
Первый синтез биологически активного пептида был осуществлен Дю Виньо и его коллегами в 1953 году. Ими были синтезированы два девяти звенных пептидных гормона - окситоцин и вазопрессин. За этим последовал синтез 39-звенного адренокортикотропного гормона, основной функцией ко торого является стимуляция коры надпочечников.
В начале 1960-х годов был осуществлен синтез человеческого инсулина - важного препарата для лечения такого распространенного заболевания, как сахарный диабет, вызываемый недостатком или отсутствием у больного ин сулина. Этот препарат нужен в больших количествах, так как его нужно вво дить больным ежедневно в виде инъекций. Структура человеческого инсули на, который длительное время использовался в качестве основного препарата для ежедневных инъекций больных диабетом, приведена на рис. 75. Химиче ский синтез инсулина был важным достижением биоорганической химии, хотя в настоящее время этот метод получения инсулина не используется. Че ловеческий инсулин получают генно-инженерными методами. Как видно из приведенной формулы на рис. 75, инсулин состоит из двух полипептидных цепей: цепи А, состоящей из 21 аминокислотного остатка, и цепи В (30 ами нокислотных остатков), соединенных двумя дисульфидными мостиками.
Наконец, в 1969 году был завершен первый синтез фермента - РНКазы из поджелудочной железы (РНКазы А), катализирующей расщепление РНК по межнуклеотидным остаткам, связывающим пиримидиновый нуклеотид со следующим за ним произвольным рибонуклеотидом.
Пептидная связь - прочная связь. Это находит отражение в величине сво бодной энергии гидролиза амидной связи, AG0Pudp « -12 кДж/моль (от -3 до -4 ккал/моль). Для образования пептидных связей необходимо затратить энергию. Это достигается либо использованием активированного производ-
204 Глава 10. Химический синтез пептидов и белков
A |
s i |
10 I |
15 |
20 |
|
|
|
|
G I V E Q C C T S I |
C S L Y Q L E N Y C N |
|
|
|||
|
F V N Q H L C G S H |
L V E A L Y L V C G E R G F F Y T Р К Т |
|||||
|
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
30 |
Рис. 75. Структура человеческого инсулина. А и В - полипептидные цепи, линия ми обозначены дисульфидные мостики
ного одного из компонентов, которое способно реагировать со вторым ком понентом без затраты энергии, либо путем сопряжения образования пептид ной связи с каким-либо превращением, сопровождающимся существенным понижением свободной энергии. Во всех нашедших применение в пептидной химии активированных производных активации подвергается карбоксильная группа С-компонента. В этом случае энергия затрачивается при получении активированного производного. В качестве таковых используются ангидриды (§ 10.2) и активированные эфиры (§ 10.4). Сопряжение также реализуется в карбодиимидном методе синтеза, который основан на промежуточном обра зовании производного с активированной карбоксильной группой С-ком- понента, но без его выделения (§ 10.3).
При соединении С-компонента с N-компонентом нужно избежать как ре акции между двумя молекулами С-компонента, так и реакции между двумя молекулами N-компонента. Эта проблема совершенно аналогична рассмот ренной при олигонуклеотидном синтезе. Все используемые методы пептид ного синтеза основаны на реакции активированного С-компонента с N- компонентом. Поэтому при образовании каждой новой пептидной связи нуж но использовать С-компонент, а-аминогруппа которого защищена так, чтобы защитную группу можно было бы удалить перед стадией образования сле дующей пептидной связи без повреждения ранее образованных. Эта защит ная группа является временной. Аналогично у N-компонента должна отсут ствовать свободная карбоксильная группа или какие-либо ее активированные производные. Кроме того, активированные карбоксильные группы и реагенты, используемые для их введения, могут взаимодействовать с неко торыми из боковых радикалов аминокислот, и последние также следует за щищать для введения этих аминокислот в пептидный синтез. Такие защит ные группы должны сохраняться на протяжении всего синтеза и удаляться на заключительной стадии, т. е. являются постоянными. Используемые в пеп тидной химии методы введения и удаления защитных групп описываются в § 10.5-10.7. Для ступенчатого синтеза, следовательно, в общем виде урав нение для каждой стадии удлинения пептидной цепи можно записать сле дующим образом:
Z -N H -C H R rC O -X + N H 2-C H R /.rC O -N H - -►
§ 10.2. Методы образования пептидных связей. Метод смешанных ангидридов 205
Z-NH-CHRrCO-NH-CHR/.r CO-NH •
где Z - временная защитная группа, R - защищенные боковые радикалы, X - остаток, активирующий карбоксил. По этой схеме синтез проводится в на правлении N-конца создаваемой цепи.
Защитные группы, кроме своей основной функции (предотвращение не желательных реакций), могут выполнять некоторые «дополнительные» функ ции: изменять растворимость пептида, его гидрофобность, молекулярную массу и т. д.
Наконец, для получения пептидов и белков необходимо сохранение опти ческой чистоты получаемых продуктов. Между тем активация карбоксиль ной группы и само образование пептидной связи в той или иной мере сопро вождается некоторым обращением конфигурации при а-углеродном атоме, т. е. рацемизацией аминокислотного остатка. Механизм рацемизации и мето ды, позволяющие в наибольшей мере избежать ее, рассмотрены в § 10.9.
§ 10.2. Методы образования пептидных связей. Метод смешанных ангидридов
Первые работы по образованию пептидных связей между аминокислота ми были выполнены в самом начале XX века. Эмиль Фишер (Fischer, 1903) применил для этого ацилирование а-аминогруппы одной аминокислоты хлорангидридом другой аминокислоты, защищенной с помощью группы Z по аминогруппе:
Z-NH-CHR-C(0)-Cl + NH2 CHR1 C (0)0C 2 H5 ->
-» Z-NHCHRC^NHCHR^COOCzHs
где Z - защитная группа.
Теодор Курциус (Curtius, 1902) предложил для той же цели азидный ме тод, в котором ацилирующим агентом служил азид защищенной по амино группе аминокислоты, получавшийся последовательной этерификацией кар боксильной группы, превращением эфира в гидразид, обработкой гидрази ном и превращением последнего в азид обработкой азотистой кислотой:
206 |
Глава 10. Химический синтез пептидов и белков |
Z-NH-CHRi-C(0)0C2 H5 + NH2 NH2^ Z-NHCHRACONHNHz
Z-NHCHR^CONHNHz + HN02^ 1ЧН2 СН^С(0)М 3
Z-NHCHR^CONs + NH2 CHR2 COOZ’ -> Z-NHCHR^ONHCHRzCOOZ'
где Z, Z’ - защитные группы, Ri,R.2- боковые радикалы.
Оба подхода могут квалифицироваться как метод смешанных ангидри дов, поскольку хлорангидриды рассматриваются как смешанные ангидриды аминокислоты и НС1, а азиды - как смешанные ангидриды с азотистоводо родной кислотой HN3.
Вдальнейшем были использованы и другие смешанные ангидриды, но
внастоящее время метод смешанных ангидридов не используется в связи
ссозданием более эффективных и менее осложненных рацемизацией мето дов, рассматриваемых в следующих разделах этой главы.
Стоит упомянуть применение внутримолекулярных ангидридов, обра зующихся при обработке а-аминокислот фосгеном. При реакции с фосгеном аминогруппа образует фрагмент хлорангидрида карбаминовой кислоты, ко торый затем взаимодействует с а-карбоксильной группой, превращаясь в N- карбоксиангидрид (ангидрид Лейкса, по имени получившего его автора).
м
£ = ° О CI
Такие ангидриды могут использоваться для ступенчатого синтеза пепти дов, но свое основное применение они нашли для синтеза полиаминокислот, сыгравших большую роль в установлении общих принципов формирования пространственной структуры белков. В присутствии нуклеофила Nu, роль которого, в частности в щелочной среде, могут играть а-ЫН2-группы следо вых количеств свободной аминокислоты, происходит ацилирование нуклео фила с освобождением фрагмента карбаминовой кислоты. При слабокислых pH последний декарбоксилируется, и освобождается новая аминогруппа, ко торая в щелочной среде может ацилироваться новой молекулой ангидрида Лейкса.
§10.2. Методы образования пептидных связей. Метод смешанных ангидридов 207
Nu-C-CH-NH-C-CH-NH, |
||
I |
I |
2 |
R |
R |
|
Многократное повторение этих процессов приводит к полиаминокислоте. Такой подход требует постоянного регулирования pH среды: конденсация N- карбоксиангидрида с аминокислотой проводится при pH 10,2, при подкислении до pH 5,0 осуществляется /V-декарбоксилирование производных карбаминовой кислоты, затем цикл реакции повторяется. Обычно синтез ведут при температуре 0-3 °С в течение 2 мин на каджую стадию (иногда этот прием с «качанием» на каждой стадии между двумя значениями pH называют «рНвесы»).
|
|
|
|
СОСГ |
|
|
|
|
|
|
r |
О |
R' |
|
|
|
|
\ |
II |
/ |
|
|
|
|
^.c h - c - n h - ch |
||
|
|
|
|
H3N |
|
\ |
|
|
|
|
|
c o o |
|
R |
^ |
О |
pH 5 ^ ? |
|
|
|
Ос о , |
|
|
||||
RV |
? |
" |
/ R' |
|
|
|
|
— |
с \ |
|
|
||
Н+ HNh*\ |
|
NH-CH |
|
|
|
|
|
ч |
|
|
|
Рацемизация, возможная во время пребывания системы в щелочной сре де, при синтезе полиаминкислот незначительна.
208Глава 10. Химический синтез пептидов и белков
§10.3. Карбодиимидный метод синтеза
Как уже говорилось в начале этой главы, для осуществления процесса об разования пептидной связи необходимо затратить энергию. Одним из подхо дов к решению этой задачи является карбодиимидный синтез - образование пептидной связи сопряженно с гидратацией дизамещенных карбодиимидов, протекающей по реакции
X1-N=C=N-X2 + Н20 -» X^NH-CO-NH-Хг
Этот реагент, введенный в практику пептидного синтеза в 1955 году Дж. Шиеном и Г. Гессом, в дальнейшем сыграл важную роль в решении це лого ряда задач химии пептидов и нуклеотидной химии. Авторы предложили использовать для конденсации двух аминокислот М,И'-дщиклогекст- карбодиимид (ДЦК). При смешении в эквимолярных количествах N- защищенной аминокислоты и сложного эфира другой аминокислоты в при сутствии этого реагента происходит быстрое образование пептидной связи, а побочный продукт реакции (Л^Л^'-дициклогексилмочевина, ДЦГМ) легко удаляется благодаря чрезвычайно низкой ее растворимости в применяемых для проведения реакции растворителях. В некоторых случаях целесообразно использовать карбодиимиды с другими заместителями. В частности, нашли разнообразное применение водорастворимые карбодиимиды, например, 1-циклогексил-3-(2-морфолинийэтил)карбодиимид (в виде и-толуолсульфо- ната) и 1-этил-3(3-диметиламинопропил)карбодиимид.
н3с
C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2
Активация карбоксильной группы аминокислоты происходит в результа те атаки карбоксилат-аниона на атом С протонированного карбодиимида. Повидимому, при этом образуется активное промежуточное соединение - дизамещенная 0-ацилизомочевина. Последняя, скорее всего в протонированной форме, атакует а-аминогруппу N-компонента с образованием пептидной свя зи с защищенной по N-концу второй аминокислотой, образуя соответствую щий пептид.
§ 10.3. Карбодиимидный метод синтеза |
209 |
Р |
f . |
|
,р |
Ь |
N Ан + |
^ |
vA^CH-C |
NH |
|
^ C H -Q |
|
I V |
А |
NHZ O' “ |
NHZ’ |
N |
|
||
nm m |
N |
|
|
||
|
|
|
t |
|
|
|
|
k 2 |
|
k 2 |
|
р |
|
ь |
Р |
|
ь |
'V'CH-C/^v |
NH |
^CH-CN |
|
NH |
|
1 |
|
||||
nhzA |
° - |
-с |
NHZ-, NH |
+ 0=С |
|
п-ч |
|||||
|
|
N |
CHR2 |
NH |
|
н—N—Н |
Х2V |
| |
Z |
хI 2 |
|
|
coz2 |
|
|||
I |
|
|
|
|
|
CHRo |
|
|
|
|
|
| |
г |
|
|
|
|
coz2
Из-за высокой реакционной способности О-ацилизомочевина обладает низкой селективностью к различным кислород- и азотсодержащим нуклео филам. Поэтому аминолиз обычно сопровождается конкурентными реакция ми с другими нуклеофилами, в том числе со вторым карбоксилат-анионом с образованием ангидрида, с атомом N второй молекулой карбодиимида с образованием N-ацилмочевины и внутримолекулярной реакцией с атомом N собственной а-амидной группой с образованием 5(4Н)-оксазолона. (В ли тературе эту же структуру можно встретить под названиями азлактон, дигид- рооксазол-1,3-он-5, оксазолинон, 1,3-оксазолинон-5, 2-оксазолинон-5.)
р |
|
f - |
p |
|
*1 |
|
|
NH |
/v'C H -Q |
|
|
|
|
\ |
1 |
|
NH |
N H Z ^ |
0 |
-cll~W |
— ► NHZ-) 9 |
+ |
0=С |
V |
|
r H* |
c = o |
|
NH |
° v сi |
° - |
X2 |
C H -R i |
*2 |
|
|
|||||
|
NHZ1 |
|
|||
|
|
|
|||
CH-R! |
|
|
|
|
|
1 |
1 |
|
|
|
|
NHZ!
Образующийся в этой реакции ангидрид достаточно реакционноспособен и может реагировать с TV-компонентом с образованием пептидной связи. При этом от ангидрида отщепляется С-компонент, который может снова активи роваться карбодиимидом и образовывать новую пептидную связь. Образова