110 |
Глава 5. Химико-ферментативный синтез нуклеиновых кислот |
||||
|
(MeOfcTrNuc^— |
СО(СН2)2СООН + |
NH2(CH2)3Si— Р |
||
|
|
|
| |
TPS-CI, N-метилимидазол |
|
|
(MeO^TrNuc/— СО(СН2)2СОО---- NH(CH2)3Sb—Р |
||||
|
|
|
| |
CF3COOH в СН2С12 |
|
|
Nuc;— |
СО(СН2)2СОО---- NH(CH2)3Si— Р |
|||
|
|
|
I |
(MeO)2TrNuc2---- OP(OX)N(iPr)2 |
|
|
|
|
I |
Н+(тетразол) в СН3СО—С=ГМ |
|
|
(MeO)2TrNuc2J— ОР(ОХ)----Nuc/---- СО(СН2)2СО— NH(CH2)3Si—Р |
||||
|
|
|
I |
(СН3С0)20, диметиламинопиридин |
|
|
|
|
▼ |
в СН3СО— C=N (кэпирование) |
|
|
|
|
| |
12, водный пиридин |
|
|
|
|
I |
CF3COOH в СН2С12 |
|
|
О |
|
|
|
|
|
NuCj—О—Р—О—Nuc/—СО(СН2)2СО—NH(CH2)3Si—Р |
||||
|
™ |
|
I |
(п-2) раза |
|
|
|
|
I |
||
|
|
о |
|
|
|
|
|
II |
|
|
|
|
(MeO)2TrNucn— О—Р ~ 0 - ••• -Nuc;—CO(CH2)2CO-NH(CH2)3Si-P |
||||
|
|
OX |
// |
\\ |
|
|
|
|
I |
||
|
|
|
I |
О |
-SH + (CH3)3N |
|
|
|
|
NH3 |
(конц.) |
ft
(MeO)2TrNucn— O - P - O ----- Nuc/
0 ~
CF3COOH в CH2CI2
О
II
Nuc— О—P -O - ... -Nuc;
Рис. 44. Схема твердофазного фосфитамидного синтеза олигонуклеотида: Nucj - остатки нуклеозида; N u c’j - остатки нуклеозидов с защищенной экзоциклической
аминогруппой; Р - нерастворимый носитель
§ 5.4. Твердофазный метод синтеза олиго- и полинуклеотидов |
111 |
вавших избытков существенно удорожает синтез. Это не играет большой ро ли, когда нужно получить за короткое время небольшие (микрограммовые) количества разнообразных олигонуклеотидов. Однако если речь идет о полу чении продукта в значительных количествах для дальнейших исследований, возрастание избытка синтона на каждой стадии делает синтез малоэкономич ным. Поэтому проблема получения путем автоматического синтеза препара тивных количеств продукта требует улучшения стадии конденсации, и в этом направлении еще предстоит серьезная работа.
5.4.2. Олигонуклеотидные микрочипы
В последние годы стали все чаще возникать задачи, требующие одновре менного синтеза очень большого числа различных иммобилизованных на подложке олигонуклеотидов. Это находит особенно широкое применение для создания так называемых микрочипов, которые требуются для проведения гибридизационного анализа с участием одновременно большого числа участ вующих в гибридизации олигонуклеотидов. Первоначально подход разраба тывался для создания нового метода секвенирования нуклеиновых кислот. На подложку можно нанести в виде отдельных пятен, например, 4096 (84) окта нуклеотидов, представляющих собой все мыслимые последовательности из восьми нуклеотидов. Каждая последовательность занимает определенное ме сто на подложке (микрочипе). Поэтому по положению сигнала, полученного от какой-либо точки на микрочипе, однозначно определяется, с каким олиго нуклеотидом связано наличие этого сигнала. Например, гибридизация нахо дящихся на чипе олигонуклеотидов с фрагментом ДНК, несущим флуорес центную метку, позволяет по положению флуоресцирующих пятен опреде лить, с какими октануклеотидами гибридизуется фрагмент и, следовательно, какие нуклеотидные последовательности присутствуют в этом фрагменте. По этим данным можно, как правило, установить полную последовательность нуклеотидов в этом фрагменте. Такой подход оказался весьма эффективным для выявления наличия мутаций в исследуемом образце, например, вирусной нуклеиновой кислоты, причем, естественно, он годится и для исследования вирусных РНК.
Подход, основанный на синтезе большого набора однотипных соедине ний, сканирование этого набора и выявление тех, которые несут интересую щее исследователя свойство (в рассмотренном случае - способность гибридизоваться с исследуемой нуклеиновой кислотой), относят к основной задаче
комбинаторной химии.
Естественно, что создать такие чипы можно, проведя химический синтез всех необходимых для анализа олигонуклеотидов и затем нанося их с помо щью специального механического устройства на подложку с целью иммоби лизации. Однако более перспективной представляется возможность осущест вить одновременный синтез всего набора олигонуклеотидов непосредственно
112 |
Глава 5. Химико-ферментативный синтез нуклеиновых кислот |
на пластинке. Для этого нужно изменить некоторые химические стадии син теза. Одним из заманчивых методов является использование вместо диметокситритильной такой защитной группы для 5’-ОН нуклеозида, которая удаля ется фотохимически (фотолитография). Тогда перед очередной конденсаци ей, например, с производным dA, можно, наложив на пластинку специальную «маску», закрыть все участки, по которым на данном этапе присоединения dA не требуется, фотохимически удалить защитную группу только с тех 5’-концов, по которым должен реагировать dA, и далее провести следующую стадию конденсации на самом чипе в нужных местах. Конечно, при этом для каждого следующего шага нужна своя заранее спроектированная «маска». Уже на первой стадии иммобилизации какого-либо вспомогательного спейсера, несущего такую группу, можно, используя заранее спроектированную маску, провести присоединение только того нуклеозида, который будет фи гурировать как первый в синтезируемой серии. Такую процедуру можно по вторить со всеми четырьмя синтонами и получить пластинку, на которой в нужных местах находятся первые нуклеозиды. Аналогично можно прово дить и все последующие стадии конденсации.
В качестве такой группы, удаляемой фотохимически, предложена 1-(2-
нитро-4,5-метилендиоксифенил)этил-1-оксикарбонильная группа. Ниже при ведена структура этой группы и ее введение в фосфоамидит.
О |
о |
(V |
В |
N02 O-C-CI |
Ы02 О-С-О' |
|
|
|
|
|
|
V- 0 |
о |
CI |
|
\ - о |
|
||
|
|
||
|
(iPr)2N '' |
р |
:=N |
|
''O' |
|
Группа вводится с помощью соответствующего хлорформиата и может быть удалена фотохимически облучением при 365 нм.
§ 5.5. Полимеразная цепная реакция |
113 |
§ 5.5. Полимеразная цепная реакция
Возможность практически неограниченного размножения дуплексов, описанная в § 1.3, лежит в основе нашедшего широчайшее применение в практике процесса, получившего название полимеразная цепная реакция (ПЦР), или амплификация. Существует несколько различных вариантов ис пользования ПЦР, но для того, чтобы понять принцип процесса, в качестве примера можно ограничиться описанием процесса получения большого чис ла копий некоторого двунитевого фрагмента ДНК. При этом предполагается, что нуклеотидная последовательность фрагмента известна. Схема процесса представлена на рис. 45.
На стадии (аО исходная двунитевая ДНК 1 частично или полностью дена турируется, чтобы подлежащие амплификации участки превратились в однонитевые и могли образовывать комплексы с соответствующими праймерами. Это достигается нагреванием образца до температуры, существенно превы шающей температуру плавления дуплекса (см. § 5.1). Если нуклеотидные по следовательности достаточно протяженных участков 3’-концов амплифицируемых фрагментов известны, тогда праймеры получают синтетически. При быстром охлаждении и достаточном избытке праймеров разделенные участ ки на стадии (б|) образуют комплексы (Г ) и (1” ) с праймерами, и в присут ствии ДНК-полимеразы и четырех dNTP на стадии (вО происходит синтез цепи (2’ и 2 ”), комплементарной амплифицируемому фрагменту и фланки рующей его 5’-конец полинуклеотидной цепи. Совокупность стадий (а), (б) и (в) обычно квалифицируется как цикл амплификации. Дальнейшая процедура состоит в последовательном чередовании аналогичных циклов - нагревания для денатурации дуплексов, охлаждения для комплексообразования с прай мерами и репликации с помощью ДНК-полимеразы.
ПЦР проводится без каких-либо промежуточных разделений смеси, и ис ходная ДНК присутствует на всех последующих стадиях амплификации, но по мере умножения количества полинуклеотидного материала ее доля про грессивно уменьшается и становится исчезающе малой. В каждом после дующем цикле амплификации на ней, как на матрице, производятся новые полинуклеотиды 2’ и 2”, причем их содержание возрастает линейно. В то же время они ведут себя как матрицы, на них образуются полинуклеотиды 3’ иЗ” , полностью воспроизводящие обе нити амлифицируемого фрагмента, но, в отличие от 2’ и 2” , не содержащие каких-либо дополнительных цепей. Эти полинуклеотиды в последующих циклах служат матрицами для самовоспроизводства, т. е. в каждом последующем цикле их количество удваивается и, следовательно, растет экспоненциально. Так, повторение процесса п раз теоретически приводит к увеличению числа дуплексов в 2П'2 раза, например, за 20 циклов амплификации число дуплексов может увеличиться более чем
114 |
Глава 5. Химико-ферментативный синтез нуклеиновых кислот |
1111 н .............I II И II 1]ХЦ
( (а.)
-37^V4V'
| (б,)
5!ГПГТ1 If
"-"Ии
5'
I <»,)
___11.1111111111111111111^
yfffhi n i n m i ..........
J (a*)
~^4v\
5^Hvn
У
| (62)
3
I *****
| (n-2) раза
*
2<n - 2) дуплексов
(1)
(!’)
(1")
d')
(1")
(2')
(!’)
(2")
(1")
(3')
(2’)
(3")
(2")
Рис. 45. Схема амплификации фрагмента ДНК. Горизонтальными линиями обо значены полинуклеотидные цепи и праймеры, вертикальными - водородные связи, соединяющие комплементарные фрагменты между собой или с праймерами
§ 5.5. Полимеразная цепная реакция |
115 |
в 105раз. Поэтому в конце амплификации доля полинуклеотидов 2’ и 2” ни чтожна.
Чтобы избежать повторного добавления фермента при повторении стадий амплификации, используют ферменты из термофильных организмов, кото рые сохраняют свою активность при повышении температуры на стадии плавления дуплекса. Чаще всего используют фермент из бактерий thermus aquaticus (Гад-полимераза).
Определить полученное количество амплифицированных дуплексов, т. е. эффективность амплификации, можно, проанализировав полученный про дукт путем электрофореза конечной реакционной смеси.
Практически при проведении ПЦР результат амплификации может не достигать приведенного выше масштаба (неполная денатурация на стадии плавления, неполное образование дуплексов с праймерами, инактивация фермента). Поэтому развито несколько методов количественного наблюде ния за ходом процесса (ПЦР в реальном времени). Все они основаны на ис пользовании регистрации флуоресценции по ходу процесса. Одним из подхо дов является определение в процессе ПЦР количества дуплексов, которое можно регистрировать с помощью специальных красителей, обладающих флуоресценцией, резко возрастающей при интеркаляции в полинуклеотидную двойную спираль. К числу таких интеркаляторов относится, в частности, широко используемый в практике ПЦР краситель SYBR green I (Xmax возбуж дения 498 нм, Хщах испускания 522 нм).
Амплификация может быть использована и для получения некоторых производных олигонуклеотидов и фрагментов ДНК. Можно в качестве прай меров использовать олигонуклеотиды, имеющие на 5’-конце группу, которую желательно ввести в продукт амплификации, например, биотин. Последний, в силу своего исключительно высокого сродства к белкам авидину и стрептавидину, позволяет избирательно сорбировать продукты амплификации на соответствующем иммобилизованном белке. Кроме того, при репликации можно вводить некоторые производные dNTP, у которых к гетероциклу при соединена какая-либо группа, например, фотореакционноспособная, если она не препятствует участию такого производного dNTP в реакции элонгации.
116 |
Глава 5. Химико-ферментативный синтез нуклеиновых кислот |
Полимеразная цепная реакция нашла многочисленные практические при менения в тех случаях, когда в распоряжении исследователя имеется недос таточное количество биологического материала. В первую очередь с этой проблемой сталкиваются при пренатальной диагностике, позволяющей вы явить нежелательные генетические отклонения на ранних стадиях развития плода. С необходимостью увеличить количество генетического материала приходится иметь дело при изучении генетического материала ископаемых биологических объектов. С этой же проблемой сталкиваются в судебной практике для установления личности преступника по оставленным им следам и для установления отцовства. В силу большой практической значимости ПЦР и необходимости проводить многократно повторяющиеся операции в настоящее время выпускаются специальные приборы - амплификаторы.
§ 5.6. Соединение олигонуклеотидов, расположенных стык в стык на комплементарной матрице
Длина природных генов слишком велика, чтобы можно было осущест вить их синтез в виде одного, пусть и многостадийного, процесса. Это было тем более немыслимо в период синтеза первого гена. Поэтому Корана пред ложил синтезировать сравнительно короткие олигонуклеотиды, способные организовать дуплексную структуру с разрывами, которые можно соединить между собой подобно тому, как это делается в природе при репликации ДНК с воссоединением фрагментов Оказаки (см. § 1.3). Суть этого процесса со стоит в соединении олигонуклеотидов на комплементарной матрице. На рис. 46 представлена схема процесса на примере сборки такой структуры из пяти олигонуклеотидов.
Для соединения олигонуклеотидов I и II используется вспомогательный олигонуклеотид III, 5’-конец которого комплементарен 5’-концу олигонукле отида I, а З’-конец - З’-концу олигонуклеотида II. В присутствии ДНК-лигазы и донора фосфата (АТР или NAD+) происходят последовательно перенос фосфата от донора к 5’-концевому фосфату олигонуклеотида I и образование межнуклеотидной связи между концами соединяемых олигонуклеотидов с отщеплением ортофосфата. При этом на обоих концах дуплекса, образо ванного соединенным олигонуклеотидом I-II и олигонуклеотидом III, обра зуются выступающие однонитевые концы, которые могут быть использованы для присоединения аналогичным образом двух олигонуклеотидов IV и V. Если при этом образуются новые выступающие однонитевые концы, то про цедура может быть продолжена. Соединение двух олигонуклеотидов, ориен тированных относительно друг друга за счет их взаимодействия со вспомогатель ной комплементарной нуклеиновой кислотой, принято называтьлигированием.
При синтезе гена, предназначенного для встраивания в какую-либо несу щую конструкцию (геном или плазмиду), на его концах оставляют выступаю-
§ 5.6. Соединение олигонуклеотидов, расположенных стык в стык |
117 |
||||||
|
I |
Р он |
II |
|
|
|
|
но |
Г 1II III 1111 |
IIII НИ 111 |
0ц------ р |
|
|||
|
|
111 |
|
|
|
|
|
|
|
| |
ДНК-лигаза (+ АТР или NAD*) |
|
|||
|
|
III |
|
|
|
|
|
но |
^ПТГШП ПГ11И1111111110„ |
р |
|
||||
|
|
III |
|
|
|
|
|
|
|
I |
|
|
|
|
|
р____ н° r u n n i n g ' i i i i mi mi i Mi i i i mn |
| lllllllll гг|, |
он |
|||||
IV |
НО Р |
|
|
НО Р |
V |
||
|
|
|
|||||
|
|
| |
ДНК-лигаза |
(+ АТР или NAD*) |
|
||
|
|
III |
|
|
|
|
|
р____ но м 11111м м 1м г т т т т п т м 11щ щ | | м м 111ж р |
он |
||||||
|
|
IV-III-V |
|
|
|
|
Рис. 46. Схема ступенчатой сборки фрагмента двуспиральной ДНК из олигодезоксирибонуклеотидов I, И, III, IV, V путем ферментативного соединения 5’- концевого фосфата одного и 3’-концевой ОН-группы другого олигонуклеотида, соб ранных стык в стык на комплементарной матрице. Обозначения те же, что на рис. 45
щие концы, комплементарные однонитевым концам, образовавшимся при разрезании несущей конструкции какой-либо рестриктазой. Затем при обра ботке раствора, содержащего синтезированный ген и разрезанную несущую конструкцию, ДНК-лигазой и донором фосфата образуется нужная структура. Схема встраивания гена в плазмиду путем лигирования приведена на рис. 47.
Использование схемы ступенчатой сборки полинуклеотидов открыло путь к синтезу длинных полинуклеотидных цепей из химически синтезиро ванных олигонуклеотидов. В ее классическом виде она содержит как хими ческую, так и ферментативную стадию, и эта стратегия известна как химико ферментативный синтез. Наряду с этим в Московском государственном уни верситете 3. А. Шабаровой был предложен и разработан чисто химический метод, основанный на химическом соединении олигонуклеотидных фрагмен тов в дуплексах, т. е. на химическом лигировании. Удобным реагентом для этой цели оказался бромциан, с помощью которого химическое лигирование протекает за минуты. Важной особенностью этого подхода является возмож ность получать дуплексы, а тем самым и олигонуклеотиды, содержащие не природные типы связей, и нуклеотиды, содержащие вместо рибозы другие углеводы. Например, при лигировании двух олигонуклеотидов, один из кото-
118 Глава 5. Химико-ферментативный синтез нуклеиновых кислот
\
-рСрТ pGpCpApG - -GpApCpGpTрСр -
t
© j
pG------------- |
рСрТpGpCpA-OH |
HO-ApCpGpTрСр------------- |
Gp |
|
pG^^^^pCpTpGpCpA-OH |
(5)1 HO-ApCpGpTрСр -vwwvww^Gp |
|
OH |
OH |
I |
I |
-pCpTpGpCpApG -vvvwvvvw^pCpTpGpCpApG- |
|
— GpApCpGpTpCp^vw |
-GpApCpGpTpC- |
OH |
OH |
® |
J |
-pCpTpGpCpApG-^ |
- pCpTpGpCpApG- |
— GpApCpGpTpCp^ |
^-GpApCpGpTpC- |
Рис. 47. Схема встраивания синтезированного гена в плазмиду: 1 - расщепление плазмиды по сайту узнавания; 2 - добавление к разрезанной плазмиде встраиваемого гена с липкими концами; 3 - сшивание конструкции с помощью ДНК-лигазы
рых на стыкующемся конце имеет 3’-, а другой - 5’-фосфат, получается оли гонуклеотид, в котором два остатка нуклеозида связаны пирофосфатной группой.
Сближение двух способных реагировать между собой групп, связанных с олигонуклеотидами, с помощью вспомогательной комплементарной нук леиновой кислоты (матрицы) моделирует один из основных факторов, дейст вующих при ферментативном катализе. Однако такой процесс не является каталитическим, поскольку речь идет об одноактном процессе. В то же время такое сближение и, таким образом, кардинальное ускорение реакции могут быть осуществлены не только для соединения фосфата с ОН-группой или двух фосфатов, но и для других многочисленных, способных взаимодействовать групп.
§ 5.7. Производные и аналоги олигонуклеотидов |
119 |
§ 5.7. Производные и аналоги олигонуклеотидов
Производные и аналоги олигонуклеотидов примененяются как в самой биоорганической химии, так и в ее многочисленных приложениях. Это обу словлено в первую очередь двумя важными свойствами олигонуклеотидов: их способностью к специфичным взаимодействиям с комплементарными по следовательностями в составе нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов и способностью олигонуклеотидов с некоторыми уникальными последователь ностями специфично взаимодействовать с определенными ферментами, имеющими активные центры, которые узнают такие последовательности.
В § 5.5 уже было описано применение олигонуклеотидов для создания микрочипов для выявления мутаций. Связывание олигонуклеотидов с функ ционально значимыми фрагментами однонитевых ДНК и мРНК существенно влияет на экспрессию этих нуклеиновых кислот и рассматривается как пер спективный подход к значительному ослаблению или полному подавлению такой экспрессии. Указанный подход, получивший название антисмыслового, детально рассматривается в § 12.3.
Производные олигонуклеотидов создаются для придания им некоторых новых свойств. Для детекции флуоресцентными методами широко использу ется присоединение к олигонуклеотидам соответствующих красителей; для придания им гидрофобности с целью облегчить их прохождение через био логические мембраны их связывают с объемными неполярными радикалами. Несвойственную реакционную способность можно обеспечить путем при соединения к ним соответствующих химически активных групп. Для прида ния им специфической сорбируемости на твердых носителях к ним присое диняют специальные радикалы, например, биотин для сорбции на носителях, содержащих стрептавидин.
Практически все задачи, связанные с применением производных олиго нуклеотидов, предполагают использование их способности к высокоспеци фичным взаимодействиям. Поэтому получение производных не должно со провождаться нарушениями тех элементов структуры, которые обеспечивают такие взаимодействия. В случае, когда предполагается использовать способ ность олигонуклеотидов к образованию дуплексных структур, в производных должны сохраняться стороны гетероциклов, обеспечивающие специфичные взаимодействия. Однако можно использовать противоположные стороны. У пиримидиновых гетероциклов таковыми являются атомы С5 и С6, у пури нов - имидазольная часть пуриновых циклов. У последних, в частности, можно заменить атом N7 на атом С. Атом С8 можно использовать для при соединения не слишком объемистых остатков, поскольку нужно избегать пе рехода модифицированного пурина из анти- в син-конформацию, так как