razdel_3

непрозрачный экран (диск) с прозрачной кольцевой диафрагмой(2) таким образом, чтобы свет не заполнял в плоскости микрообъекта(3) апертуры объектива (4), то поле зрения микроскопа в отсутствие микрообъекта будет соответственно темным.

Рис.69. Принципиальная оптическая схема темнопольного микроскопа

Но если в препарате имеются микроструктуры, свет на них будет

микроскопию в темном поле называют ультрамикроскопией.

В цито- и гистохимии этот метод микроскопирования применяется

62

голландский физик Ф.Цернике развил теорию метода, разработал удобное геометрическое представление о методе и осуществил его на практике в

30-х годах прошлого века (Zernike F., Physica,9,656,914,1942).

Известно, что различия в показателях преломления между внутриклеточными структурами и окружающей их средой незначительные, в

связи с чем сдвиг между фазами света, прошедшими через внутриклеточные микроструктуры и среду, практически не приводит при их сложении

(интерференции) к изменению амплитуды суммированной волны. Ф.Цернике показал, что если фазу прямого света(света, прошедшего через среду)

сдвинуть искусственно на90 градусов относительно света, прошедшего через объект ("отклоненного", дифрагированного света), то фазовые различия между светом, прошедшим через объект и среду, будут практически равны четверти длины волны и в этом случае их интерференция будет приводить к изменению амплитуды световой волны, а

сами структуры будут видны при микроскопическом анализе, за счет увеличения их контраста относительно окружающей их среды.

На практике это реализуется следующим образом(рис.70). Свет от источника попадает на кольцевую диафрагму(1), изображение которой строится конденсором (2) в фокальной плоскости объектива(3). В этой плоскости устанавливается фазовая пластинка (4), представляющая диск с кольцевой канавкой (или напылением), создающая опережение(или отставание) по фазе равное π / 2.

63

Рис.70. Метод фазового контраста

Размер изображения фазового кольца должен точно совпадать с кольцевой диафрагмой конденсора. Таким образом, весь прямой свет, прошедший через

микроструктуры анализируемого препарата, вследствие чего в плоскости (6)

получается контрастное изображение, в котором структурам с большим показателем преломления будут соответствовать более темные участки

("позитивный контраст"). Для получения "негативного контраста", когда структурам с большим показателем преломления будут соответствовать более светлые участки изображения, фазовая кольцевая пластинка в фокальной плоскости объектива изготавливается путем напыления, что приводит к отставанию фазы прямого света на π / 2.

Фазово-контрастная микроскопия играет огромную роль в изучении живых клеток, клеточных культур и тонких тканевых эксплантатов

(переживающей ткани). При помощи фазово-контрастной микроскопии изучается влияние гистохимических фиксаторов на морфологию клеток,

влияние различных физико-химических факторов на изменение клеточных

64

микроструктур. Кроме этого, фазово-контрастная микроскопия играет незаменимую роль в изучении движения клеток и внутриклеточных органелл в нормальных условиях и при патологических процессах. Для цито- и гистохимии метод фазового контраста является мощным дополнительным инструментом для изучения морфологии клеток и тканей.

3.5.3. Интерференционная микроскопия

Явление интерференции представляет сложение двух когерентных волн,

в результате которого возникает третья волна. Амплитуда и фаза результирующей волны зависят от того, насколько одна из составляющих волн опережает другую, т.е. от величины разности хода Т, или сдвига фаз между ними - :

= 2 π T / λ , λ - длина волны света.

волн Т зависит от толщины микрообъекта(d) и разницы показателей преломления объекта (no) и среды (nc): Т=d(no-nc), поэтому сдвиг фаз связан

микрообъектов, т.е. для превращения "фазовых объектов" в "амплитудные объекты".

В случае интерференционного микроскопа для получения

интерференционного контраста используется следующая принципиальная схема (рис.71).

65

Рис. 71. Схема интерферометра

длину опорного луча, т.е. приводить к плавному изменению сдвига между

опорным лучом и лучом, в который помещен микрообъект. Если

компенсатор снабжен приспособлением для отсчета величины перемещения луча AВD, можно измерять разность хода луча (Т), вносимой объектом

влуче АСD. Таким образом, интерференционная микроскопия

контраст изображения интерференционной картины.

При помощи компенсатора интерференционного микроскопа можно

3.5.3.1. Определение показателя преломления

Показатель преломления клетки или внутриклеточной органгеллы, или ее фрагмента (nо), определяется по формуле:

nо = Т/d + nc,

где d - толщина объекта, а nс - показатель преломления среды. Так как точное измерение d на практике является практически невозможным,

проводится измерение Т1 и Т2 последовательно в двух средах с известными nс1 и nс2 и тогда можно использовать формулу:

nо = (Tnc1 - Tnc2) / (T2 - T1)

3.5.3.2. Определение толщины объекта

Из приведенного выше уравнения видно, что толщина микрообъектов

(d) равна:

d = Т / no - nc см

Если показатель преломления объекта (no) неизвестен, то измерения

Т1 и Т2 последовательно проводят, как в предыдущих измерениях, в двух

68

M = TS / 100 α (г / 1клетку)

Величина 100α (называется иногда χ [хи]) для разных биологически важных веществ колеблется в пределах от 0.14 до 0.20 и

зависит от химического строения вещества, рН раствора и от длины волны. Важно, что в последнее уравнение не входит величина толщины клетки, что измерять довольно трудно, а входит площадь клетки, что легче поддается прямому измерению.

позволяет судить об их структуре и физико-химических свойствах.

Как известно, плоско-поляризованные волны можно получить при помощи специальных оптических устройств - поляроидов или призм,

приготовленных из двоякопреломляющих материалов. На рис. 72 а

Рис.72. Принципиальная схема поляризационного микроскопа

представлена схема поляризационного микроскопа. Если после источника света (1) и коллекторной линзы осветителя (2) поставить первый поляроид - поляризатор (3), свет в конденсор (4) будет проходить плоскополяризованным и попадать на препарат (5), расположенный на вращающемся столике (6). После объектива (7) в оптической схеме

запаздывания фаз (Г) между двумя составляющими волнами, возникшими в двоякопреломляющем объекте равна:

Г = d (nc - no),

где d - толщина микрообъекта, nc - показатель преломления среды, no - показатель преломления микрообъекта. Например, если обнаружено,

что Г = λ / 2, при λ = 550 нм, и толщине микрообъекта 10 мкм = 104 нм,

то nc - no равно: 225 нм / 104нм = 0,0225. Зная значение nc можно рассчитать значение no.

Микроскопия в поляризованном свете играет важную роль в изучении анизатропии внутриклеточных органелл и упаковке больших молекул, что

70

наряду с электронной микроскопией дает большую информацию о субмикроскопическом строении внутриклеточных органелл.

3.5.5. Ультрафиолетовая микроскопия

Микроскопия в ультафиолетовой области спектра практически не

отличается от микроскопии в видимой области спектра, за исключением

того, что при этом для освещения микрообъектов используется

ультрафиолетовый свет. В связи с этим, в ультрафиолетовых микроскопах

внутриклеточные соединения обладают выраженной собственной

содержащих ароматические аминокислоты.

2). Как указывалось выше, разрешающая сила микроскопа зависит от

длины волны света, используемого при освещении препаратов, причем разрешение увеличивается при использовании света в коротковолновой

части спектра. Поэтому в ультрафиолетовой области спектра разрешение

микрообъектов выше, чем в видимой области спектра, например, при