razdel_3

1

ОСНОВЫ ГИСТОХИМИИ

Раздел 3. Свет, красители, микроскопия

С О Д Е Р Ж А Н И Е

(используйте гипертекст)

Глава 1. Взаимодействие света с веществом

1.1. Взаимодействие света с веществом. Введение 1.2. Свет – электромагнитная волна (волновая теория) 1.3. Поляризация света 1.4. Квантовая природа света

1.5. Закон Бугера-Ламберта-Беера 1.6. Флуоресценция

Контрольные вопросы Рекомендуемая литература

Глава 2. Красители 2.1. Восприятие цветности соединений

2.2. Основные характеристики цвета

2.3. Избирательное поглощение света

2.4. Теория цветности

2.5. Энергия возбуждения молекул

2.6. Структура молекул и цветность 2.6.1 . Сопряженные двойные связи в молекулах и цветность 2.6.2. Поляризующие группы

2.6.3. Копланарность молекул красителей

2.7. Комплексообразование с металлами

2.8. Классификация красителей

2.9. Особенности использования красителей в гистохимии Контрольные вопросы Рекомендуемая литература

2

Глава 3. Микроскопия Введение

3.1. Линза. Основные понятия

3.2. Лупа

3.3. Микроскоп. Принципиальная схема

3.3.1. Осветительная система микроскопа

3.3.2. Оптическое разрешение микроскопа

3.3.3. Аберрации

3.3.4. Объективы

3.3.5. Окуляры 3.3.6. Объект-микрометр и окулярная сетка

3.3.7. Конструкция микроскопа

3.4. Оптические свойства биологических микрообъектов

3.5. Специальные методы микроскопии

3.5.1. Метод темного поля

3.5.2. Метод фазового контраста

3.5.3. Интерференционная микроскопия 3.5.3.1. Определение показателя преломления

3.5.3.2. Определение толщины микрообъекта 3.5.3.3. Определение сухого веса

3.5.4. Поляризационная микроскопия

3.5.5. Ультрафиолетовая микроскопия

3.5.6. Флуоресцентная микроскопия Контрольные вопросы Рекомендуемая литература

3

Глава 1. Взаимодействие света с веществом

1.1.Взаимодействие света с веществом. Введение

Врезультате большинства гистохимических реакций происходит взаимодействие эндогенных соединений клеток и тканей с определенными гистохимическими реактивами и образование окрашенных комплексов,

локализация которых анализируется при помощи светового микроскопа, а

количественный анализ проводится при помощи микроспектрофотометрии.

В качестве гистохимических реактивов используются: красители;

соединения, реакция которых с эндогенными соединениями приводитк образованию красителей или окрашенных комплексов; промежуточные соединения, взаимодействие которых с эндогенными соединениями приводит к продуктам, легко вступающим в реакции с красителями и соединениями, указанными выше. Особые виды гистохимических реакций связаны с взаимодействием: меченных красителями или радиоактивными метками антител с клеточными и тканевыми антигенами (иммуноцито- и

иммуногистохимия); меченных радиоактивными метками зондов -

фрагментов ДНК или РНК, комплементарных к изучаемой мРНК (метод гибридизации мРНК in situ); меченных соединений с внутриклеточными метаболитами (гисторадиоавтография).

Использование практически всех перечисленных гистохимических реагентов приводит, как указывалось выше, к образованию окрашенных

физической оптики и химии красителей. Поэтому ниже кратко разбираются те вопросы, которые представляют интерес для гистохимика.

1.2. Свет - электромагнитная волна (волновая теория)

5

Рис.47. Структура электромагнитной волны

Любой волновой процесс характеризуется двумя основными параметрами: длиной волны (лямбда) и частотой колебаний в секунду.

Диапазон длин волн спектра электромагнитного излучения представлен в табл.1.

Табл.1

(*) Ǻ - ангстрем 10-8 см или 10-10 м

Большинство красителей, используемых в гистохимическом анализе,

обладают поглощением в видимой части спектра, в диапазоне от 400 до 800

нм, но ряд внутриклеточных соединений сами поглощают свет в области ультрафиолетового и видимого участков спектра электромагнитных волн.

6

Частота электромагнитных волн (ν) или число колебаний волны в секунду, связана с длиной волны (С ) соотношением:

ν = С / λ

где, С - скорость света в вакууме, равная 3х108 м/с; l - длина волны.

Для некоторых длин волн ультрафиолетового и видимого света частоты будут равны следующим величинам:

Величина, обратная длине волны, выраженной в см, называется волновым числом и равна числу длин волн, умещающихся в одном см:

ν* = 1/ λ см

Значения волновых чисел для ультрафиолетового и видимого

диапазона света равны:

λ= 200 нм ν*= 5,0• 108 см

λ= 400 нм ν*= 2,5•108 см

λ= 600 нм ν*= 1,7•108 см

λ= 800 нм ν*= 1,25•108 см

Убедительным доказательством волновой природы света служит

явление интерференции света. С интерференцией света связан один из

А=Ао sin х ,

где Ао - максимальная амплитуда волны. Если такая волна попадает на оптически прозрачный объект (т.е. объект не изменяющий амплитуду волны), то скорость распространения волны уменьшается относительно скорости распространения световой волны в вакууме на определенную величину (рис.48 б).

8

Из этого уравнения видно, что если в изучаемом микрообъекте расположены вещества с одинаковыми значениями n, они не будут влиять на сдвиг фаз между волнами, прошедшими через эти вещества. В случае различия в показателях преломления веществ внутри разных микроструктур будет возникать разница фаз волн, прошедших через эти микроструктуры (рис. 48 б). В случае, когда разница в показателях преломления, например, двух микроструктур приведет к отставанию в них волн на 2p (вторая волна находится в противофазе к волне, прошедшей через первую структуру - (рис. 48 б)), интерференция этих двух волн будет приводить к взаимному "гашению" света и в интерференционной картине мы увидим уменьшение амплитуды суммарного света до нуля.

Интерференционные явления лежат в основе фазово-контрастной и интерференционной микроскопии (см. ниже).

1.3. Поляризация света

Как указывалось выше обычный свет неполяризован, т.е. электрические и

магнитные векторы расположены хаотично. Однако, если на пути

неполяризованного света поставить призму, изготовленную, например, из

исландского шпата, т.е. материала с сильным двойным

лучепреломлением, можно получить плоско поляризованный свет. Если такой плоско поляризованный свет проходит через анизотропный объект,

то такой объект будет разлагать поляризованный свет на два луча,

поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Один из лучей называется обыкновенным и характеризуется обычным законом преломления, а другой луч - необыкновенный проходит через объект с иной скоростью.

Как показано выше, мерой скорости света в веществе является показатель преломления. Если обозначить показатели преломления для обыкновенного и необыкновенного лучей какnо и nн, соответственно, то разница (nн - nо) будет характеризовать степень двойного лучепреломления. Для очень сильно двупреломляющих материалов -

9

например, кристаллы кальцита, эта величина равна 0,1, но даже в строго ориентированных искусственных волокнах она редко достигает величины

0,05.

Большинство биологических объектов, даже с высокой молекулярной

ориентацией, например, живые мышечные волокна, которые считаются

Т = (nн - nо) d

где: d - толщина объекта (Т выражается обычно в долях длины волны или

в метрических единицах длины - Ă или нм). Поляризационная микроскопия может быть использована не только для аналитических целей определения в тканях и клетках ориентированных (анизотропных) структур и молекулярных комплексов, но и для визуализации определенных структур,

которые не видны в фазово-контрастном или интерференционном микроскопе, а окраска которых не представляется возможной (см. ниже).

1.4. Квантовая природа света

При изучении механизмов и законов связанных с поглощением света веществом и, соответственно, превращением энергии поглощенного света в химическую, тепловую энергию или в энергию излучаемого света

(флуоресценция и фосфоресценция), свет трактуется как поток частиц -

квантов. В 1900 г. М.Планк вывел уравнение, согласно которому излучатель света выделяет энергию в окружающую среду в виде "порций",

называемых квантами. В квантовой теории М.Планка предполагается, что

втвердом веществе имеется много осцилляторов, характеризующихся

осциллятора равна: Е = hn , где: h - постоянная Планка (6,625•10-34 дж•с),

n- частота.

10

Энергия кванта света обычно выражается в джоулях (Дж) или в

электронвольтах (Эв): 1 Эв = 1,602 •10 -19 Дж = 1,602 •10 –22 кДж

В этом случае постоянная Планка равна:

h = 6,625 •10-34 Дж •с = 4• 10-15 Эв•с

Как указывалось выше, для качественного и количественного анализа локализации продуктов гистохимических реакций в клетках и тканях используется, в основном, ультрафиолетовая и видимая часть оптического спектра.

Поэтому рассчитаем энергию квантов света в ультрафиолетовой (УФ) и

видимой области спектра:

Е200 = 4 •10-15 Эв •с (3• 1010 см/с : 2•10-5 см) ≈ 6 Эв

Расчет энергии квантов света с другими длинами волны показал:

Е300 ≈ 4 Эв, Е400 ≈ 3 Эв, Е500 ≈ 2,4 Эв, Е600 ≈ 2 Эв, Е700 ≈ 1,7 Эв.

Таким образом, видно, что энергия кванта УФ-света выше, чем энергия квантов света в видимой области спектра и при увеличении длины волны-

т.е. при переходе в длинноволновую часть спектра, энергия кванта света уменьшается. Это очень важный количественный параметр света,

значение которого будет видно ниже, особенно, при анализе флуоресценции. 1.5. Закон Бугера-Ламберта-Беера

Количественная связь между поглощением энергии света и концентрацией вещества, через которое проходит свет, устанавливается законом Бугера-Ламберта-Беера. Рассмотрим взаимодействие монохроматического света с поглощающим веществом (рис.49),

находящимся в виде гомогенного (истинного) раствора в кювете толщиной d:

Рис.49. Схема кюветы с раствором, содержащем вещество с концентрацией [C]. Объяснения в тексте