razdel_3

11

Iо , в соответсвии с законом Бугера-Ламберта, связано с толщиной слоя вещества в кювете следующим образом:

I / Io = e –kd

При выводе этого уравнения предполагается, что молекулы поглощающего вещества распределены в кювете конечной толщины d

настолько редко, что они не экранируют друг друга.

По закону Беера константа k пропорциональна концентрации поглощающего вещества:

k = ε [C]

коэффициента k в уравнение Бугера-Ламберта получится уравнение Бугера-

Ламберта–Беера, которое является основным уравнением

фотометрических измерений концентрации веществ в растворах:

I / Io = e -ε [C] d

На практике для удобства использования этим уравнением обе части его логарифмируют, при этом закон Бугера-Ламберта-Беера представляется в следующем виде:

lg (I / Io) = - ε [C] d, или

lg (Io / I) = ε [C]d

Величина lg (Iо / I) называется оптической плотностью раствора и обозначается обычно буквой D (density) (или А - absorption):

D = ε [C]d

Молярный коэффициент поглощения e для молекул красителей,

хромофоров и других органических соединений, поглощающих свет,

составляет:

13

E* → E1 + hν1

В этом случае происходит испускание кванта света - флуоресценция. Так как часть энергии поглощенного кванта света теряется при переходе из

возбужденного состояния в виде тепловой энергии, энергия испускаемого фотона всегда меньше, чем энергия поглощенного кванта света, т.е. hn >

hn1. Это количественная разница энергии поглощенного и испускаемого в акте флуоресценции света называется правилом Стокса. Согласно этому

правилу длина волны света флуоресценциивсегда сдвинута в более

длинноволновую часть спектра, по сравнению с длиной волны поглощенного фотона.

Часто поглощаемый в случае флуоресценции свет называется возбуждающим светом (спектр возбуждения), а испускаемый свет - светом

флуоресценции (спектр флуоресценции). Таким образом, спектры

монохроматическим светом в полосе его поглощения находится всяполоса спектра возбуждения данного соединения.

Способность молекул испускать поглощенную энергию в виде квантов флуоресценции характеризуется величиной выхода флуоресценции j:

φ = Nф / Nп

Nj - число излучаемых квантов света (число молекул излучивших

квантовый выход этого флуорохрома более чем на порядок ниже, чем для

концентрацию флуоресцирующего соединения можно расчитать согласно следующему уравнению:

15

[C] = Iф / Io α

Как указывалось выше, при высоких концентрациях флуоресцирующих

соединений приведенная зависимость перестает работать в связи с

Контрольные вопросы

1.Красители в гистохимии (общая характеристика).

2.Взаимодействие света с красителями (общие проблемы).

3.Свет - электромагнитная волна. Что такое длина волны ? Волновое число. Что такое частота электромагнитной волны.

4.Спектр электромагнитных волн, характеристика длин волн и частот для УФ и

"видимой"

8.Квантовая природа света. Энергия квантов света с длиной волны 200, 300 ....700 нм.

9.Закон Бугера-Ламберта-Беера. Оптическая плотность.

10.Использование закона Бугера-Ламберта-Беера в количественном гистохимическом анализе.

11.. Флуоресценция и фосфоресценция. Энергия возбужденных состояний.

12. Правило Стокса. Квантовый выход флуоресценции. Тушение флуоресценции.

13.Количественный флуоресцентный анализ.

14.Использование флуоресцентной микроскопии в гистохимии.

16

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

(Раздел 3, гл.1)

1.Теренин А.П. Фотоника молекул красителей. Наука, Л., 1967.

2.Теренин А.П. Фотохимия красителей. Издание АН СССР, 1947.

3.Векшин Н.Л. Фотоника биологических структур, Пущино, 1988.

4.Шишловский А.А. Прикладная физическая оптика, Физматгиз, 1961.

5.Чанг Р. Физическая химия с приложением к биологическим системам,

Мир, 1980, стр.94-103, 191-196, гл.18.

6.Уильямс В., Уильямс Х. Физическая химия для биологов. Мир, 1976, стр. гл.9.

7.Стейси Р. и др. Основы биологической и медицинской физики, М.,

Мир, 1959, гл.5.

8.Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки, М.,

Наука, 1978.

17

Глава 2. Красители

2.1. Восприятие цветности органических соединений

Человеческий глаз различает только часть оптического спектра

зрительных ощущений света. Одновременное, совокупное действие всех лучей в указанном диапазоне видимого спектра вызывает ощущение белого цвета, в то время как монохроматический свет дает ощущение окрашенного цвета. Известна следующая классификация восприятия человеческого глаза цвета прозрачных и непрозрачных предметов при освещении их "белым" светом:

·Все лучи видимой части спектра полностью отражаются

непрозрачной поверхностью или полностью проходят сквозь прозрачный предмет. В этом случае непрозрачный предмет представляется белым, прозрачный - бесцветным.

·Предмет воспринимается черным, если "белый" свет полностью им поглощается.

19

Все видимые нами цвета и оттенки можно разделить на хроматические

или темно-зеленый.

в) Относительная яркость - степень приближения ощущения

монохроматического цвета к ощущению белого цвета. Например,

относительная яркость желтого цвета выше красного, синего - ниже голубого и т.д.

Ахроматические цвета определяются только одной характеристикой-

относительной яркостью.

Смешивание нескольких цветов дает возможность получить широкую

гамму цветов. Различают оптическое смешение и механическое смешение цветов. Если на сетчатку глаза одновременно попадают,

например, голубой и желтый свет, то мы будем ощущать серый цвет

(оптическое смешивание цветов). Но при механическом смешивании

2.3. Избирательное поглощение света

пропускания, а красители с коричневыми, оливковыми, серыми и другими цветовыми тонами характеризуются спектрами поглощения без четкого

максимума. С другой стороны, сложение двух цветов приводит к спектру с двумя максимумами.

определенного спектрального состава представлены в так называемой

окраска органических соединений обусловлена наличием в их молекулах

(хромогены по Витту). Однако, соединения, имеющие только указанные

группы, не являются еще красителями, обладают невысоким сродством

с окрашиваемыми материалами и сами окрашены с низкой интенсивностью.

Для взаимодействия красителя с различными материалами и усиления цвета в молекуле красителя должны присутствовать группы,

названные ауксохромами. К таким группам относятся: гидроксильная группа (-ОН), аминогруппа (-NН2 ), метиламинная группа (-N(СН3)2 и