razdel_1
.pdf
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
21 |
|
замороженной |
ткани. Определение конца сублимации. |
Сопротивление |
высушенного |
|
||||||||||||||||||||||
слоя. Артефакты |
при сублимационной |
сушке, |
методы |
их |
уменьшения. |
Основные |
|
|||||||||||||||||||
приемы |
обработки |
|
лиофилизированной |
ткани |
для |
гистохимических |
целей. |
|
||||||||||||||||||
Метод замещения льда в тканях в замороженном состоянии, основные принципы. |
|
|||||||||||||||||||||||||
Метилцеллозольв. Использование ацетона в замещении в замороженном состоянии. |
|
|
||||||||||||||||||||||||
|
|
МИКРОТОМИЯ ТКАНЕЙ. Что такое микротомия тканей? "Толстые" и "тонкие" |
|
|||||||||||||||||||||||
срезы. |
|
Типы |
микротомии (классификация). |
Типы |
микротомов |
(ротационный, |
|
|||||||||||||||||||
салазочный). |
|
Криостат. |
|
Резаки |
|
и |
вибратомы. Подготовка ткани для микротомии. |
|
||||||||||||||||||
Материалы |
|
для |
заливки |
тканейдля |
|
микротомии |
(общая |
|
характеристика). |
|
||||||||||||||||
Водорастворимые |
|
пластмассы (поливиниловый |
|
спирт. |
полиэтиленгликоли). |
|
||||||||||||||||||||
Гелеобразующие заливочные материалы (желатин, агар). Парафин (способы заливки). |
|
|||||||||||||||||||||||||
Заливка ткани в целлоидин. Общая конструкция криостата МК-25. |
Подготовка |
ткани |
|
|||||||||||||||||||||||
для |
микротомирования |
в |
|
криостате. |
|
Общая |
конструкция |
салазочного микротома. |
|
|||||||||||||||||
Общая |
|
конструкция |
ротационного |
|
|
микротома. |
Замораживающий |
микротом. |
|
|||||||||||||||||
Конструкция микротомных ножей. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
МАНИПУЛЯЦИИ СО СРЕЗАМИ ТКАНЕЙ. Подготовка предметных |
и |
|
||||||||||||||||||||||
покровных стекол. Основные параметры предметных и покровных стекол(толщина, |
|
|||||||||||||||||||||||||
размеры |
и |
др.). |
|
Маркировка |
предметных |
стекол. |
Приклеивание срезов к |
|
||||||||||||||||||
предметным стеклам. Получение срезов на замораживающем микротоме: манипуляции |
|
|||||||||||||||||||||||||
со |
срезами. |
|
Приготовление срезов |
в |
криостате: |
манипуляции |
со |
срезами. |
|
|||||||||||||||||
Изготовление |
срезов |
из |
парафиновых |
блоков(перенос |
срезов, |
расправление |
срезов и |
|
||||||||||||||||||
др.). Манипуляции со срезами тканей залитых в целлоидин. Нагревательный столик. |
|
|||||||||||||||||||||||||
|
|
КРАСИТЕЛИ И МИКРОСКОПИЯ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
|
ОСНОВЫ ОПТИКИ. Красители в гистохимии (общая характеристика). |
|
|
||||||||||||||||||||||
Взаимодействие света с красителями (общие проблемы). Свет - электромагнитная |
|
|||||||||||||||||||||||||
волна. |
Что |
такое длина волны ? |
Волновое число. Что такое частота электромагнитной |
|
||||||||||||||||||||||
волны. |
Спектр |
электромагнитных |
|
волн, |
характеристика длин волн и частот для УФ и |
|
||||||||||||||||||||
"видимой" области спектра. |
Интерференция |
и |
ее |
использование |
в |
микроскопии. |
|
|||||||||||||||||||
Показатель преломления. |
Фазовые и амплитудные |
объекты |
для микроскопирования. |
|
||||||||||||||||||||||
Поляризация |
света и |
ее |
|
использование |
в микроскопии. Квантовая природа |
света. |
|
|||||||||||||||||||
Энергия |
квантов |
света |
с |
длиной волны 200, 300 ....700 нм. |
|
Закон Бугера-Ламберта- |
|
|||||||||||||||||||
Беера. |
|
Оптическая |
|
плотность. |
Использование |
закона |
|
Бугера-Ламберта-Беера |
в |
|||||||||||||||||
количественном |
гистохимическом |
анализе. Флуоресценция и фосфоресценция. Энергия |
|
|||||||||||||||||||||||
возбужденных |
состояний. Правило Стокса. Квантовый |
выход |
флуоресценции. |
|
||||||||||||||||||||||
Тушение |
флуоресценции. |
Количественный |
флуоресцентный анализ. Использование |
|
||||||||||||||||||||||
флуоресцентной микроскопии в гистохимии. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||
|
|
МИКРОСКОПИЯ. Основные элементы светооптического |
микроскопа. Основы |
|
||||||||||||||||||||||
геометрической оптики (линза, плоскость объекта, плоскость изображения, фокус и др.). |
|
|||||||||||||||||||||||||
Хроматическая |
|
аберрация. |
Сферическая |
аберрация. Астигматизм, |
кома. Что |
такое |
|
|||||||||||||||||||
ахроматы, апланхроматы, анастигматы. Оптическое разрешение |
микроскопа. |
Апертура |
|
|||||||||||||||||||||||
объектива. Связь увеличения, апертуры, рабочего расстояния и диаметра поля зрения |
|
|||||||||||||||||||||||||
объективов микроскопов. Оптическая система светооптического микроскопа. |
|
|||||||||||||||||||||||||
Освещение объектов |
в |
|
микроскопах. |
Увеличение микроскопа (связь |
с |
оптическим |
|
|||||||||||||||||||
разрешением). |
|
Масляная |
иммерсия. |
|
Оптические |
свойства |
|
биологических |
|
|||||||||||||||||
микроскопических объектов (клеток и |
тканей). |
Общая |
характеристика |
методов |
|
|||||||||||||||||||||
микроскопии. |
Метод |
|
|
темного |
|
. поля Фазово-контрастная |
|
микроскопия. |
|
|||||||||||||||||
Интерференционная микроскопия. |
Использование |
интерференционной |
микроскопии |
|
||||||||||||||||||||||
в |
гистохимии. |
Поляризационная |
микроскопия. |
Ультрафиолетовая |
микроскопия |
|
||||||||||||||||||||
(применение |
|
в |
гистохимии). Флуоресцентный микроскоп, |
устройство, особенности. |
|
|||||||||||||||||||||
Использование |
флуоресцентной микроскопии в гистохимии. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
КРАСИТЕЛИ. |
Восприятие |
цвета |
глазом |
человека |
("белый" |
цвет, |
|
||||||||||||||||
монохроматический цвет). Прозрачные |
и |
непрозрачные |
тела |
(общая характеристика). |
|
|||||||||||||||||||||
22
Спектральные и дополнительные цвета. Батохромный сдвиг. Гипсохромный сдвиг. Хроматические и ахроматические цвета. Основные характеристики хроматических и
ахроматических |
цветов |
(цветовой |
тон, |
насыщенность, |
относительная |
яркость). |
||||||||||
Оптическое |
и |
механическое |
смешение |
цветов. |
|
Спектральные |
характеристики |
|||||||||
красителей (связь с |
цветностью). |
Хромофорно-ауксохромная |
теория |
цветности |
||||||||||||
органических молекул. Хромофорные группы |
в красителях. |
Ауксохромные группы в |
||||||||||||||
молекулах |
красителей. |
Электронная |
|
теория |
|
цветности |
красителей. |
Энергия |
||||||||
возбуждения |
молекул красителей |
и |
органических |
соединений. |
Величина |
энергии |
||||||||||
возбуждения |
светом |
с длиной волны 400 и 760 |
нм. Структура |
молекул |
и их |
|||||||||||
цветность. Энергия |
возбуждения |
связей |
в |
молекулах s-электронамис (насыщенные |
||||||||||||
углеводороды). |
Энергия |
возбуждения |
|
связей |
в |
молекулах |
с |
p-электронами |
||||||||
(ненасыщенные углеводороды). |
Поляризация атомных групп в |
молекулах |
красителей |
|||||||||||||
(п-электроны). Роль электрон-донорных и электрон-акцепторных групп в молекулах красителей. Ионизация молекул красителей. Компланарность молекул и связь с цветовыми параметрами. Комплексообразование красителей с металлами(протравные красители). Классификация красителей по химической структуре молекул (основные классы красителей).
ТИПЫ ГИСТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
(Классификация гистохимических реакций)
1. Прямое использование красителей в гистохимии.
Амидо-черный 10В - окраска белков. Использование бромфенолового синего. Основные и кислые красители. Базофилия и ацидофилия. Метахромазия. Лаки и хелатные соединения. Выявление нуклеиновых кислот краплаком галлоцианина. Смесь метилового зеленого-пиронина в гистохимии нуклеиновых кислот. Жирорастворимые красители и гистохимия липидов. Красители - Суданы и нильский голубой.
2. Флуорохромы и люминесцентная микроскопия.
Акридиновый оранжевый и другие производные акридина в гистохимии нуклеиновых кислот и мукополисахаридов. Прижизненные методы с использованием флуорохромов. Интравитальная микроскопия.
3. Превращение лейкоформ красителей в хромофорные формы.
Реактив Шиффа. Реакция Фельгена. Использование реактива Шиффа в гистохимии углеводов (ШИК - реакция). Количественная гистохимия - микрофотометрия.
4. Образование красителей в ходе гистохимической реакции.
Азокрасители. Азосочетание и синтез азокрасителей в ходе гистохимической реакции. Использование азокрасителй в гистохимии ферментов. Нафтолы. Выявление фосфатаз при помощи азосочетаний.
5. Соли тетразолия как гистохимические реактивы.
Сопряженные реакции в гистохимии. Образование формазанов. Использоавание солей тетразолия в гистохимии окислительных ферментов. Реакция Гленнера для выявления активности моноаминоксидазы.
6. Реакции с образованием солей тяжелых металлов.
23
Использование солей тяжелых металлов в гистохимии ферментов (на примере фосфатаз). Выявление щелочной фосфатазы при помощи нитрата кобальта (Реакция Гомори-Такаматчу). Выявление кислой фосфатазы при помощи нитрата свинца (Метод Гомори). Ферроцианид меди и гистохимия холинэстераз.
7.Образование люминесцирующих продуктов в ходе гистохимической реакции.
Реакция Фалька-Хилларпа на биогенные амины. Количественная люминесцентная микроскопия (микрофлуориметрия).
8. Иммуноцитохимия.
Общие принципы. Методы иммуноцитохимии. Использование иммуноцитохимии в
гистохимии |
пептидов и |
белков. |
Иммуноцитохимия |
низкомолекулярных |
|
соединений. |
Контроли |
и артефакты в |
иммуноцитохимии. Люмнесцентная |
||
иммуноцитохимия. |
|
|
|
|
|
9. Гибридизация mРНК in situ.
Основные принципы и методы. Место метода в современной гистохимии. Артефакты и проблемы метода. Изучение локализации синтеза белков в тканях.
10. УФ-микроскопия и микроскопия собственной флуоресценции внутриклеточных соединений, использование в гистохимии.
11. Использование блокаторов химических групп в гистохимии.
Проблема артефактов в гистохимии. Контрольные препараты в гистохимии (пример). Микробиохимия - вариант количественной гистохимии. Динамическая гистохимия (кинетика гистохимических реакций).
12. Значение гистохимии в фундаментальных цитологических исследованиях (изучение клеточного метаболизма, клеточного цикла и др.). Гистохимия и медицина (цитопатология, цитодиагностика).
Примечание: |
Данная |
программа |
в |
разные |
годы |
чтения |
лекций |
в |
Пущи |
||
Государственном |
университете |
претерпевала |
небольшие |
изменения. Программа |
|
||||||
рассчитана на |
первый |
семестр магистратуры как |
спецкурс. Разделы: «Основы оптики», |
|
|||||||
«Микроскопия» |
и |
«Красители» предлагались |
|
для |
самостоятельного |
изучения |
|||||
магистрантами |
и |
|
обсуждения |
|
на |
семин. Наконецрах, отдельные |
разделы |
|
|||
«Микротехники» и «Типы гистохимических реакций» используются для чтения лекций в Пущинском филиале Московского Государственного университета им. М.В.Ломоносова на втором курсе бакалавриата в разделе«Знакомство с экспериментальными методами биологии».