2.Культура растительных клеток и тканей как основа биотехнологии растений

В основе метода культуры клеток и тканей растений лежит уникальное свойство растительной клетки – тотипотентность. Тотипотентность – это способность клетки реализовывать генетическую информацию, обеспечивающую ее дифференцировку и развитие до целого организма

Тотипотентность присуща оплодотворенной яйцеклетке растений и животных. Что же касается дифференцированных клеток, то у животных тотипотентность присуща только некоторым клеткам кишечнополостных. У высших животных с началом специализации клеток, т.е. уже начиная с ранних этапов эмбриогенеза, тотипотентность не реализуется. В отличие от животных у растений в природных условиях тотипотентность могут проявлять и специализированные клетки. Например, тотипотентность у растений реализуется при заживлении ран. В этом случае на раневой поверхности растения в результате неорганизованной пролиферации клеток происходит развитие каллуса (лат. «мозоль»). Образование каллуса можно наблюдать при прививках в местах срастания привоя и подвоя. Каллус первоначально состоит из недифференцированных клеток. Впоследствии в нем может иметь место вторичная дифференциация с образованием специализированных тканей и органов. Однако в природных условиях растения ряда систематических групп тотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клеток многие однодольные растения утратили способность к раневой реакции и вегетативному размножению. Между тем в экспериментальных условиях in vitro при выращивании фрагментов тканей, органов или клеток на искусственных питательных средах возможна реализациясупрессированной in vivo тотипотентности. Говоря о значениитотипотентности, следует подчеркнуть, что тотипотентность, как оченьценная особенность растительной клетки, позволяет моделировать уникальные дифференцировки и экспериментально исследовать феноменэпигенетической наследственности, а также открывает огромныевозможности для генетической инженерии растений и биотехнологии.

Метод культуры клеток и тканей растений в настоящее время широко

используется для решения ряда теоретических и практических задач

биологии. Это обусловлено тем, что данный метод имеет следующие

преимущества:

• простоту клеточных моделей;

• отсутствие коррелятивных взаимодействий и контроля со стороны

• других тканей, органов, целого организма, что позволяет проследить

• состояние клетки на уровне первичных элементарных процессов в ответ

• на любые воздействия;

• возможность быстро получать достаточную массу в асептических условиях;

• контролируемые по многим параметрам условия выращивания.

Культивируемые растительные клетки используются для изучения

вторичного метаболизма, его регуляции путем блокирования или усиления

работы отдельных ферментов, а также под влиянием различных факторов.

3.Условия асептики при культивировании растительных обьектов in vitro

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Богатая питательная среда является прекрасным субстратом для развития в ней микроорганизмов, а изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами, поэтому нужно стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-бок- се) стерильными инструментами. Важно соблюдать стерильность и во время культивирования изолированных тканей, особенно при перепаде температуры и влажности, так как при этом пробки становятся влажными и по ним в пробирку могут проникать микроорганизмы.

Стерилизацию эксплантов и семян проводят, выдерживая их 5—20 мин в стерилизующих растворах с последующей многократной промывкой их стерильной водой. Продолжительность процесса зависит от характера экспланта и от стерилизующей активности раствора. Семена стерилизуют 10—20 мин, а вегетативные части — 5—10 мин (табл. 1.1)[1]. Органы растений, из которых изолируют эксплант для введения в культуру, предварительно моют щеткой в мыльном растворе и споласкивают дистиллированной водой, а затем погружают на несколько секунд в 70%-ный этанол. Семена погружают в спирт на 1—2 мин. Кроме собственно стерилизующего действия спирта обработка тканей этанолом перед помещением в основной раствор повышает стерилизующий эффект последнего.

Для стерилизации семян, верхушечных меристем, кусочков ткани, выделенных из различных частей растения, применяют следующие растворы: 0,1%-ный — сулемы (двухлористая ртуть), 0,1%-ный — диацида, 13—20%-ный — пероксида водорода, 10%- ный — хлорамина, 8%-ный — гипохлорита натрия или кальция.

Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлори- да и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (около 300 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте. Перед стерилизацией ткань растения предварительно очищают. Корнеплоды, клубни, толстые стебли растений тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, снимают кожуру (у корней и корнеплодов), кроющие чешуи (у листьев), промывают дистиллированной водой и опускают на несколько секунд (семена — на 1—2 мин) в 70%-ный этиловый спирт. Обработка тканей этанолом повышает эффект основного стерилизующего раствора. Затем растительные объекты многократно прополаскивают в стерильной воде.

Пероксид водорода рекомендуется использовать для фасоли, люпина, подсолнечника (с очищенной кожурой), сулему — для томатов, тыквы и др. Продолжительность стерилизации семян сулемой — 10—15 мин, пероксидом водорода — 30 мин, для меристем и кусочков тканей требуется примерно в 2 раза меньше времени. Опушенные семена (хлопчатник) обрабатывают концентрированной серной кислотой в течение 5 мин. Легче всего семена отмываются от пероксида водорода. После сулемы и диацида воду меняют 5—6 раз.

Семена томатов, яблони, тыквы, бобов и табака ко времени созревания заключены в мясистые, деревянистые или костянковидные покровы. Поэтому здоровые, с неповрежденной поверхностью плоды этих культур достаточно тщательно промыть мыльной водой, затем — несколько раз спиртом, после чего в строго асептических условиях их разрезают. Стерильным пинцетом вынимают семена и помещают их в стерильные чашки Петри для проращивания.

Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, то его необходимо обработать антибиотиками. Особенно богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропических растений с крупными сосудами. Загрязнение культур грибами или бактериями обычно выявляется через 3—14 суток после посадки. Загрязненные культуры необходимо тотчас же удалить, чтобы избежать заражения воздуха в световой комнате.

Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и давлении 0,7—1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательной среды входят вещества, разрушающиеся при высокой температуре, то их подвергают холодной стерилизации, пропуская через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22—0,45 мкм, после чего добавляют в проавтоклавированную охлажденную до 40 °С основную среду.

Посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 °С в течение 2 ч.

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит этиленди- аминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток.

Для получения каллусной ткани в отдельных случаях к питательной среде добавляют жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана и др.