14.Методы выращивания протопластов растительных клеток

Растительные протопласты - это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, обладающие внутриклеточными органеллами и характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм, а также реакции биосинтеза и трансформации энергии.

Впервые протопласты растительных клеток были получены при изучении плазмолиза (в 1892 г.) в клетках водного растения - телореза. Способ получения был весьма простым (если не сказать примитивным), но тем не менее с его помощью они были получены, а это главное, Тонкая полоска ткани растения видерживалась сначала в 0,1 М растворе сахарозы до тех пор, пока протопласт не "сожмется" и не отойдет от клеточных стенок, затем бритвой делался разрез полоски и протопласты высвобождались в среду. Такого рода методические приемы выделения протопластов получили название механических. Подобные методы имеют определенные ограничения: 1) с помощью их можно получить только небольшое количество протопластов; 2) можно использовать только те ткани, в клетках которых при данном способе может иметь место выраженный плазмолиз; 3) из зрелой ткани таким методом протопласты получаются с большим трудом; 4) метод довольно длительный и трудоемкий.

Принципиально отличающимся методом является ферментативный способ получения протопластов, при котором клеточная стенка удаляется с помощью ферментов. Таким методом уже в 1919 г. были получены протопласты клеток грибов в результате обработки их клеточных стенок желудочным соком улитки. В микробиологических экспериментах протопласты получались путем разрушения клеточных стенок бактерий лизоцимом. Изолирование протопластов растительных клеток с использованием ферментных препаратов было осуществлено в I960 г. (E.Cocking). По сравнению с механическими способами ферментативные методы получения протопластов имеют определенные преимущества: 1) можно одновременно получить большое количество протопластов; 2) формирующиеся протопласты не подвергаются сильному осмотическому сжатию; 3) клетки остаются менее поврежденными: 4) метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки при получении растительных протопластов используются ферментные препараты трех типов -целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Действие этих ферментов состоит в деструкции основных компонентов клеточной стенки, обеспечивающих ее механическую прочность (ригидность). У растительных клеток этими компонентами являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества, которые находятся в клеточной стенке в различных соотношениях. Поэтому комбинации ферментных препаратов и их количественные соотношения должны эмпирически подбираться для кождого конкретного случая (т.е. в зависимости от вида растения, его возраста и органа, из которого берется материал для получения протопластов).

Иными словами, оптимальные условия для получения протопластов растительных клеток весьма индивидуальны для различных тканей и в каждом случае необходима предварительная работа по подбору состава ферментов, их концентраций и времени обработки. Формирующиеся протопласты должны находиться в контакте с ферментами минимальное время, после чего их необходимо тщательно отмыть. Ферменты, естественно, должны быть стерильными (стерилизация производится, как правило, путем фильтрования через бактериальные фильтры). Важным фактором является подбор осмотического стабилизатора.