Полезные материалы за все 6 курсов / Ответы к занятиям, экзаменам / 1. Морфология и ультраструктура

Большинство бактерий образуют капсулу только в макроорганизме

(in vivo):

Streptococcus pneumoniaе – возбудитель крупозной пневмонии;

Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы;

Clostridium perfringens – возбудитель газовой гангрены;

Francisella tularensis – возбудитель туляремии;

Yersinia pestis – возбудитель чумы.

Некоторые бактерии образуют капсулу в макроорганизме и на питатель-

ной среде (in vivo и in vitro):

Klebsiella pneumoniaе – возбудитель пневмонии;

Klebsiella oxytoca– возбудитель сепсиса, инфекций мочевыводящих путей;

Klebsiella granulomatis – возбудитель паховой гранулемы.

Функции капсулы:

-в макроорганизме защищает бактерии от фагоцитоза и действия анти-

тел;

-во внешней среде предохраняет бактерии от высыхания.

Капсулу выявляют в окраске по Бурри-Гинсу. В результате окраски бак-

терии красного цвета, вокруг них бесцветные капсулы на черно-розовом фо-

не.

Klebsiella pneumoniaе в окраске по Бурри-Гинсу.

41

КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА представляет собой биополимер – пептидогликан (муреин), являющийся плотной структурой. По строению клеточной стенки грамположительные и грамотрицательные бактерии существенно отличаются друг от друга (см. занятие №2).

Функции клеточной стенки:

-придает клетке постоянную форму;

-защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление;

-участвует в транспорте метаболитов;

-несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов (вирусов бактерий) и различных химических веществ.

КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫЕ БАКТЕРИИ имеют особый химический состав клеточной стенки с повышенным количеством липидов и жирных миколовых кислот.

К ним относят:

Mycobacterium tuberculosis – возбудитель туберкулеза;

Mycobacterium leprae – возбудитель лепры;

Mycobacterium africanum – возбудитель эндемического туберкулеза в Африке;

Mycobacterium scrofulaceum – возбудитель лимфаденитов у детей;

Mycobacterium smegmatis – нормальный симбионт мочеполовой системы мужчин.

Кислотоустойчивые бактерии плохо воспринимают красители. Для их окраски и дифференцировки от других бактерий используют метод Циля-

Нильсена.

42

Окраска по Цилю-Нильсену. Механизм окраски.

- на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бума-

ги и наносят карболовый фуксин Циля. Над пламенем спиртовки подогрева-

ют мазок 2-3 раза до появления пара; - бумагу снимают, препарат обесцвечивают 5% раствором серной кисло-

ты, погружая в стаканчик с кислотой 2-3 раза;

-промывают водой, окрашивают метиленовым синим 3-5 минут;

-промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, кислото-

податливые – в синий.

Механизм окраски:

При обработке препарата карболовым фуксином Циля все клетки окра-

шиваются в красный цвет. При последующем обесцвечивании серной кисло-

той кислотоустойчивые бактерии из-за особенностей своего химического со-

става удерживают краситель. Кислотоподатливые – обесцвечиваются, поэто-

му при дальнейшем окрашивании метиленовым синим воспринимают краси-

тель и приобретают синий цвет.

L-формы бактерий, их медицинское значение.

L-формы (от названия Института им. Д. Листера, где они впервые были изучены) – это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки, но способные к размножению. Имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких сферических клеток.

L-трансформации могут подвергаться все бактерии, имеющие клеточ-

ную стенку.

L-трансформация происходит под действием различных индуцирую-

щих факторов (лизоцим, разрушающий пептидогликан, антибиотики, угне-

тающие биосинтез клеточной стенки и др.). В результате бактерии становятся устойчивыми к некоторым антибиотикам.

43

L-трансформация может быть обратимой и необратимой. Обратимая –

наблюдается при сохранении генов, кодирующих синтез клеточной стенки, и

тогда бактерии возвращаются в исходную форму.

L-формы могут образовывать многие возбудители инфекционных забо-

леваний. Это одна из причин хронизации заболеваний и форм приспособле-

ния бактерий к неблагоприятным условиям существования.

МИКОПЛАЗМЫ (УРЕАПЛАЗМЫ) – бактерии, лишенные клеточной стенки. Ее функции выполняет цитоплазматическая мембрана. В отличие от других бактерий, микоплазмы быстрее погибают в неблагоприятных услови-

ях, но устойчивы к действию бактериофагов (вирусов бактерий).

ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА (ЦПМ) располагается под клеточной стенкой. Представляет собой трехслойную мембрану. Состоит из

двойного слоя липидов и белков, пронизывающих липидные слои.

Функции ЦПМ:

-является основным осмотическим и онкотическим барьером;

-участвует в энергетическом метаболизме и активном транспорте пита-

тельных веществ в клетку, т.к. является местом локализации пермеаз (фер-

ментов-переносчиков) и ферментов окислительного фосфорилирования;

-участвует в процессах дыхания и деления;

-участвует в синтезе компонентов клеточной стенки (пептидогликана);

-участвует в выделении из клетки токсинов и ферментов.

ЦПМ выявляется при электронной микроскопии.

2. Цитоплазма, ее составные.

Цитоплазма занимает основной объем бактериальной клетки. Представ-

ляет собой аморфный матрикс, содержащий различные органические соеди-

нения, органеллы и включения.

44

-нуклеоид – центральная зона цитоплазмы. Представлен одной кольцевой молекулой ДНК, содержащей около 2000 генов. Нуклеоид не имеет ядерной оболочки, ядрышек и основных белков (гистонов). Содержит одну хромосому, имеет гаплоидный (одиночный) набор генов, поэтому клетка не способна к митотическому делению. Нуклеоид выявляется специальными методами окраски (по Романовскому-Гимзе и др.) и электронной микроскопией;

-плазмиды – небольшие молекулы ДНК, автономно присутствующие в цитоплазме в виде небольших молекул ДНК. Гены плазмид могут придавать бактериям новые свойства, способствующие их выживанию. Особое значение в медицине имеют плазмиды, обеспечивающие устойчивость бактерий к антибиотикам. У патогенных бактерий плазмиды кодируют факторы, способствующие развитию инфекционного процесса;

-рибосомы – состоят из двух субъединиц, но отличаются от рибосом эукариот молекулярной массой. Функция рибосом – синтез белка. Индикация

16S рРНК бактерий позволяет проводить их генетическую идентификацию

(см. занятие №1);

-мезосомы – являются производными ЦПМ при впячивании ее участков

вцитоплазму. Функции: участвуют в энергетическом метаболизме, в процессах деления и спорообразования;

-включения образуются в процессе жизнедеятельности клетки, накапливаются при избытке питательных веществ в окружающей среде и выполняют резервную (трофическую и энергетическую) функцию. Они представлены гранулами гликогена, крахмала, каплями жира, минеральными веществами – серой, кальцием, железом и др., а также зернами волютина. Зерна волютина по химической природе полифосфаты – являются запасным источником энергии. Для обнаружения зерен волютина используют метод окраски по Нейссеру. В результате окраски бактерии приобретают нежно-желтый цвет, а зерна волютина – темно-синий.

45

Зерна волютина имеют:

Spirillum volutans– сапрофит;

Corynebacterium diphtheriaе – возбудитель дифтерии;

Corynebacterium xerosis– нормальный симбионт конъюнктивы;

Corynebacterium ulcerans – возбудитель дифтериеподобных поражений кожи.

3. Поверхностные структуры бактериальной клетки: жгутики, пили.

Бактерии подразделяют на подвижные и неподвижные. Органами дви-

жения у бактерий являются ЖГУТИКИ. Они состоят из белка флагеллина,

который по своей структуре относят к сократительным белкам типа миозина.

Основанием жгутика является базальное тельце, состоящее из системы дис-

ков, «вмонтированных» в ЦПМ и клеточную стенку. Длина жгутика больше длины самого микроба.

По числу жгутиков и их расположению бактерии подразделяют:

-монотрихи, имеющие на конце клетки один жгутик (Vibrio choleraе);

-лофотрихи, имеющие пучок жгутиков на одном из концов клетки (Helicobacter pylori);

-амфитрихи, имеющие жгутики на обоих концах клетки (Spirillum volutans);

-перитрихи, имеющие жгутики по всему периметру клетки (Escherichia coli, Salmonella typhi).

46

Жгутики очень тонкие, поэтому их можно обнаружить только специ-

альной обработкой, при которой достигается увеличение их размера. Жгути-

ки выявляют окраской по Морозову, электронной микроскопией. Движение микробов наблюдают с помощью темно-полевой или фазово-контрастной микроскопии. Подвижность можно определить по характеру роста бактерий в полужидком агаре.

ПИЛИ (ворсинки, фимбрии) – тонкие нити белковой природы, покры-

вающие поверхность бактериальных клеток. Не выполняют двигательную функцию. Различают пили первого и второго типа.

Пили первого (общего) типа имеются у большинства бактерий. Осуще-

ствляют прикрепление (адгезию) бактерий к определенным клеткам организ-

ма. Адгезия является начальной стадией любого инфекционного процесса.

Пили второго типа, F-пили (конъюгативные или половые) есть у бак-

терий, имеющих специальную плазмиду. Их количество невелико – 1-3 на клетку.

Половые пили представляют собой длинные пустые трубочки и выпол-

няют следующие функции:

- участвуют в передаче генетического материала от одной клетки к дру-

гой при конъюгации бактерий;

- являются рецепторами для адсорбции специфических вирусов бакте-

рий – бактериофагов.

47

Жгутики и пили у бактерий

Конъюгация у бактерий

4. Спорообразование у бактерий.

СПОРООБРАЗОВАНИЕ – это способ сохранения вида в неблагопри-

ятных условиях внешней среды, но не способ размножения. Споры устойчи-

48

вы к высокой температуре, УФ-облучению, радиации, действию химических веществ, поэтому могут сохраняться в почве десятки лет (споры возбудите-

лей сибирской язвы и столбняка). Споры круглой или овальной формы могут располагаться в клетке центрально, субтерминально (ближе к концу палочки)

и терминально (на конце палочки). Спора образуется в цитоплазме в течение

18-20 часов. Прорастание спор в вегетативные клетки начинается при их по-

падании в благоприятные условия и длится 4-5 часов.

Стадии спорообразования:

1. Подготовительная. В цитоплазме бактерий образуется уплотненный уча-

сток, не имеющий свободной воды, называемый «спорогенной зоной». В ней содержится нуклеоид.

2.Стадия предспоры. Вокруг спорогенной зоны образуется оболочка из двойной ЦПМ.

3.Между двумя ЦПМ формируется кортекс, состоящий из пептидогликана.

4.Стадия созревания. С внешней стороны наружной ЦПМ образуется обо-

лочка споры с повышенным содержанием солей кальция. Затем вегетативная

часть клетки лизируется, освобождая спору.

Споры устойчивы во внешней среде за счет:

-низкого содержания воды, которая находится в связанном состоянии;

-наличия многослойной оболочки с повышенным содержанием солей кальция.

Споры обнаруживают в бактериальной клетке специальной окраской по методу Ожешко (спора окрашивается в ярко-красный цвет, вегетативная часть бактерии – в синий), или с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Спорообразующие бактерии:

Bacillus anthracis

Clostridium perfringens

Clostridium tetani

49

Clostridium botulinum

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1. Окраска препарата по Бурри-Гинсу для выявления капсул. Смешивают ка-

плю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифованным краем готовят мазок, затем высушивают и фиксируют. На остывшее стекло наливают фуксин Пфейффера (1-2 минуты), промывают водой, высушивают и микроскопируют. В результате окраски бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные (бесцветные) капсулы контрастно выделяются на чер-

но-розовом фоне.

2. Окраска препарата по Нейссеру для выявления зерен волютина. На фикси-

рованный мазок наносят уксуснокислый метиленовый синий (1 минута),

промывают водой, затем наносят раствор Люголя (30 секунд), промывают водой и докрашивают хризоидином (10-15 секунд). Затем промывают водой,

высушивают и микроскопируют. В результате окраски бактерии приобрета-

ют нежно-желтый цвет, а зерна волютина – темно-синий.

3. Приготовление и окраска препарата по Цилю-Нильсену для выявления ки-

слотоустойчивых (вакцинный штамм туберкулезных палочек (BCG)) и ки-

слотоподатливых (стафилококки) микроорганизмов.

Окраска по Цилю-Нильсену:

-на фиксированный мазок положить полоску фильтровальной бумаги, затем нанести небольшое количество карболового фуксина Циля;

-нагреть мазок над пламенем спиртовки 2-3 раза до появления пара, не дово-

дя до кипения;

- снять бумагу, дать препарату остыть и погрузить его в стаканчик с 5% рас-

твором серной кислоты 2-3 раза (для обесцвечивания);

50