Полезные материалы за все 6 курсов / Ответы к занятиям, экзаменам / 1. Морфология и ультраструктура

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1. Виды микроскопии, используемые в медицинской микробиологии.

Для диагностики инфекционных заболеваний используют световой,

темнополевой, фазово-контрастный, люминесцентный и электронный микро-

скопы.

Общее увеличение микроскопа определяют произведением увеличе-

ний объектива и окуляра.

Разрешающая способность микроскопа – это наименьшее расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно.

СВЕТОВОЙ МИКРОСКОП.

Разрешающая способность 0,2 мкм.

Предназначен для изучения формы, размеров и структуры окрашенных клеток.

При исследовании микроорганизмов применяют иммерсионный объек-

тив. Его преимущество - с помощью иммерсионного масла устанавливается оптически однородная среда с одинаковым показателем преломления между стеклом и линзой. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, чем достигается более высокая разре-

шающая способность. В качестве иммерсионного масла обычно используют кедровое или касторовое, показатель преломления которых равен показателю преломления света в стекле.

ТЕМНОПОЛЕВОЙ МИКРОСКОП (ультрамикроскоп).

Разрешающая способность – 0,02-0,04 мкм.

Предназначен для изучения формы, размеров и подвижности живых, не-

окрашенных бактерий.

31

Темное поле создается с помощью специального конденсора, в котором затемнена центральная часть и таким образом создается боковое освещение.

Поэтому в объектив попадают лучи, отраженные от объекта. Увеличение разрешающей способности микроскопа связано с тем, что отраженный луч имеет более короткую длину волны.

ФАЗОВО-КОНТРАСТНЫЙ МИКРОСКОП.

Разрешающая способность – 0,2 мкм.

Предназначен для изучения формы, подвижности и структуры живых неокрашенных бактерий.

Имеет специальный набор фазовых объективов и соответствующих им кольцевых диафрагм конденсора. С помощью этого устройства достигается преобразование невидимых фазовых колебаний преломленного луча в види-

мые амплитудные колебания.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МИКРОСКОП.

Разрешающая способность – 0,2 мкм.

Предназначен для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных ин-

фекций.

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых ве-

ществ светиться под действием коротковолновых ультрафиолетовых (УФ)

лучей. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специаль-

ными люминесцентными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, аурамин и др.). В качестве источника УФ-света обычно исполь-

зуют ртутно-кварцевую лампу. Под действием УФ-излучения окрашенные клетки начинают светиться красным или зеленым светом.

32

ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП.

Разрешающая способность – менее 1Å (Å – ангстрем, 1Å = 0,1нм = 10-4

мкм, 1 мкм=0,01мм).

Предназначен для изучения строения вирусов, бактерий и отдельных макромолекул.

Высокая разрешающая способность достигается малой длиной волны электронов. В электронном микроскопе вместо света используют поток элек-

тронов в безвоздушной среде. Источником электронов является вольфрамо-

вая нить катода, разогреваемая до высокой (2500-29000С) температуры. Роль оптических линз выполняют электромагниты. Для исследования препаратов в электронном микроскопе применяют специальные пленки, проницаемые для электронов.

2.Техника приготовления и окрашивания бактериологического препа-

рата. Принцип простого и сложного методов окраски.

Этапы приготовления мазка:

1.Собственно приготовление мазка.

2.Высушивание.

3.Фиксация.

4.Окрашивание.

1.Собственно приготовление мазка:

из культуры бактерий, выращенной в жидкой питательной среде:

-обезжирить предметное стекло;

-нанести на стекло с помощью бактериологической петли каплю куль-

туры и распределить ее параллельными движениями;

 из культуры бактерий, выращенной на плотной питательной среде:

33

- на обезжиренное стекло нанести каплю физиологического раствора, за-

тем внести в эту каплю петлей небольшое количество культуры бактерий с плотной питательной среды и распределить параллельными движениями.

2.Высушивание мазка на воздухе или высоко над пламенем спиртовки (в

струе теплого воздуха).

3.Фиксация мазка:

жаром, в пламени спиртовки – при изучении формы и расположения бак-

терий и дифференциации их при окраске сложным методом;

химическим методом – при изучении нативных (сохранивших естествен-

ную структуру) препаратов от больного (кровь, ликвор, гной и т.д.). В каче-

стве химических фиксаторов чаще используют этиловый и метиловый спирт,

а также смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в соотношении

1:1).

Цель фиксации:

-убить микроорганизмы;

-прикрепить их к предметному стеклу;

-улучшить их прокрашивание.

4.Окрашивание препарата простым и сложным методом.

Простой метод окраски позволяет изучать форму, размеры и взаимо-

расположение бактерий. Для окраски используют только один краситель,

чаще фуксин Пфейффера или метиленовый синий.

34

Принципиальный рецепт простого водно-спиртового красителя:

1 часть красителя

+

10 частей 96о этилового спирта

+

100 частей дистиллированной воды

Сложные методы окраски позволяют дифференцировать микроорга-

низмы (окраска по Граму, Цилю-Нильсену) или видеть отдельные структуры клеток (окраска по Бурри-Гинсу, Нейссеру, Романовскому-Гимзе). Для окра-

ски используют более одного красителя.

3. Окраска по Граму. Примеры грамположительных и грамотрицатель-

ных бактерий. Механизм окраски.

Окраска по Граму (в модификации Синѐва):

-на фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропи-

танную генциан-фиолетовым, смачивают водой, окрашивают 2 минуты;

-снимают бумагу и наносят на мазок раствор Люголя на 1 минуту, затем краситель сливают;

-обесцвечивают мазок 96о спиртом 10-15 секунд;

-промывают мазок водой;

-докрашивают мазок фуксином Пфейффера 30 секунд;

-промывают мазок водой, высушивают фильтровальной бумагой и микро-

скопируют.

Механизм окраски по Граму.

Дифференцировка на грамположительные и грамотрицательные бакте-

рии зависит от строения клеточной стенки, основой которой является пепти-

35

догликан. У грамположительных бактерий толщина пептидогликана 50 нм, у

грамотрицательных – не более 120 нм.

При окрашивании препарата генциан-фиолетовым, а затем раствором Люголя, образуется комплекс генциан-фиолетовый + йод. Все клетки окра-

шиваются в сине-фиолетовый цвет. При обработке спиртом у грамположи-

тельных бактерий образовавшийся комплекс не обесцвечивается. Поэтому при окрашивании фуксином Пфейффера они сохраняют сине-фиолетовый цвет. У грамотрицательных бактерий комплекс генциан-фиолетовый + йод обесцвечивается спиртом и при окраске фуксином Пфейффера они приобре-

тают розово-красный цвет.

В результате окраски бактерии дифференцируют на грамположительные

(сине-фиолетовые) или грамотрицательные (розово-красные).

К грамположительным относят все кокки (кроме нейссерий) и спорооб-

разующие бактерии. К грамотрицательным – нейссерии, неспорообразующие бактерии, спириллы.

Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных

бактерий

36

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1. С помощью преподавателя освоить технику приготовления мазка культур бактерий из жидкой и с плотной питательных сред.

Этапы приготовления мазка:

1.Собственно приготовление мазка.

-обезжирить предметное стекло сухим мылом и обвести снизу границы мазка карандашом по стеклу;

-приготовление мазка из жидкой питательной среды: прокалить петлю,

над спиртовкой открыть пробку пробирки, обжечь края пробирки, на-

брать каплю культуры петлей. Снова обжечь края пробирки и закрыть пробкой. Пробирку поставить в штатив, нанести каплю культуры на предметное стекло и распределить петлей параллельными движениями

(диаметр мазка – 0,5-1см). Прокалить петлю;

-приготовление мазка с плотной питательной среды: прокалить петлю,

над спиртовкой открыть пробирку с физиологическим раствором, обжечь края пробирки и набрать петлей каплю физиологического раствора. Сно-

ва обжечь края пробирки и закрыть пробкой. Нанести каплю на предмет-

ное стекло. Затем прокалить петлю, над спиртовкой открыть пробирку с плотной питательной средой, обжечь края пробирки. С поверхности плотной среды взять петлей немного культуры бактерий, снова обжечь края пробирки и закрыть пробкой. Внести культуру в каплю физ. раство-

ра, распределить микробную взвесь параллельными движениями (диа-

метр мазка – 0,5-1см). Прокалить петлю.

2.Высушить мазок высоко над пламенем спиртовки.

3.Фиксировать мазок жаром. Для этого стекло 3 раза внести в среднюю треть пламени спиртовки на 1-2 секунды. Приступить к окрашиванию мазка.

37

2.Самостоятельно приготовить мазки из культур стафилококков (плотная питательная среда) и кишечных палочек (жидкая питательная среда).

Окрасить мазок стафилококков метиленовым синим – 3 минуты, а мазок кишечных палочек фуксином Пфейффера – 1 минуту. Промыть мазки водой и высушить фильтровальной бумагой.

3.Приготовить мазки из смесей культур: S.epidermidis + E.сoli и

B.anthracoides + E.coli. Окрасить мазки по Граму.

4.Микроскопировать приготовленные препараты.

5.Зарисовать препараты.

38

Занятие №3

Тема. Строение бактериальной клетки. Кислотоустойчивые бактерии. Окра-

ска по Цилю-Нильсену. Спорообразование у бактерий и его значение.

Цель занятия. Изучить строение бактериальной клетки, процесс спорообра-

зования у бактерий. Освоить методику окраски препаратов по методу Циля-

Нильсена.

I.Теоретические знания:

1.Оболочечные структуры бактериальной клетки: капсула (капсульный слой), клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана. Особенности кле-

точной стенки кислотоустойчивых бактерий. Окраска по Цилю-Нильсену.

Механизм окраски. L-формы бактерий, их медицинское значение. Мико-

плазмы.

2. Цитоплазма, ее составные: нуклеоид (генофор), плазмиды, рибосомы, ме-

зосомы, включения.

3.Поверхностные структуры бактериальной клетки: жгутики, пили.

4.Спорообразование у бактерий.

II.Практические навыки:

1.Приготовление мазка кислотоустойчивых (вакцинные туберкулезные бак-

терии – BCG) и кислотоподатливых (стафилококки) бактерий.

2. Окраска мазка по Цилю-Нильсену.

39

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

К основным структурам бактериальной клетки относят оболочечные

структуры, цитоплазму и органеллы.

Строение бактериальной клетки

1.Оболочечные структуры бактериальной клетки.

Коболочечным структурам бактериальной клетки относят капсульный слой, клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану.

Снаружи многие бактерии имеют КАПСУЛЬНЫЙ СЛОЙ (МИКРО-

КАПСУЛУ). Это слизистое образование, не превышающее диаметр бактери-

альной клетки. У некоторых бактерий имеется ИСТИННАЯ КАПСУЛА –

слизистый слой, превышающий диаметр бактериальной клетки. Капсула не является обязательной структурой. У большинства бактерий она имеет поли-

сахаридную природу. У некоторых (Bacillus anthracis) – состоит из белка.

40