Протокол №14. Стафиолококковое бактерионосительство (Stafilococcus aureus).

1 этап. У обследованного отбирают слизь вращательным движением из передних отделов носа стерильным зондом-тампоном (вмонтирован в стерильную пробирку или одноразовую пробирку – тубсер). Посев материала не более чем через 2ч после забора на ЖСА тампоном. Чашки ставим в термостат на 24ч при +37С, затем еще на сутки при комнатной температуре на свету (условия образования пигмента).

2 этап. Учет роста. На ЖСА – круглые, блестящие, выпуклые, непрозрачные колонии средних размеров с золотистым пигментом, есть зоны опалесценции (есть лецитиназа). Для накопления чистой культуры отсеяли на МПА. Посевы в термостат при +37С.

3 этап. На скошенном МПА – гомогенный непрозрачный золотистый налет. Для изучения морфологии и тинкториальных свойств сделали мазок, окрасили по Граму – Гр+ кокки в виде гроздьев винограда. Для определения плазмокоагулазы (основной дифференциальный тест) используют цитратную кроличью плазму (ЦТК) – через 2ч плазма свернулась.

Протокол № 15. Исследование крови с подозрением на сепсис (Streptococcus agalactiae).

1 этап. У больного через 2ч после подъема температуры (до начала АБ-терапии) взяли 2 пробы крови из двух локтевых вен (участок кожи обработали 70% раствором спирта и 2% йода). Посев сделали непосредственно у постели больного во флаконы со средами:

• Сахарный бульон (выделение аэробов и факультативных анаэробов)

• Тиогликолевая среда (выделение анаэробов)

• Сабуро (доп выделение грибов)

В термостат при +37С, ежедневно просматриваем до появления признаков роста (до 9-10д). Также проводят микроскопирование крови: готовят 2 мазка по типу «толстой капли» (каплю растирают в центре предметного стекла, высушивают). Один мазок фиксируют и окрашивают по Граму, другой не фиксируют и окрашивают метиленовым синим. В микроскопе – немного Гр+ кокки в виде цепочек.

2 этап. На сахарном бульоне и тиогликолевой среде – рост в виде осадка. В мазках – Гр+ кокки цепочками. «+» пробы пересеяли на кровяной агар (КА), поместили в термостат при +37С на 1-2сут.

3 этап. На пластинке КА – рост нежных, полупрозрачных колоний с ровными краями, сероватые, есть обширные зоны бета-гемолиза. Поставили тесты для идентификации рода и вида:

• Тесты Шермена (на толерантность)

• БХ тесты

Для определения серогруппы по Лэнсфильду ставят латекс-АГГ (серогруппа В). Определяют чувствительность к АБ диско-диффузным методом.

4 этап. Учет дифференциальных тестов. В тестах Шермена роста нет. Реакции Фогеса-Проскауэра нет.

Протокол №16. Подозрение на менингококковый назофарингит (Neisseria meningitidis серогруппы А).

1 этап. У больного взяли слизь с задней стенки глотки натощак стерильным тампоном. Материал засеяли на 2 чашки: 20% сывороточный агар и 20% сывороточный агар с минкомицином (подавление роста Гр+ кокков). Посев делали штрихами тампоном. Чашки ставят в термостат на сутки при +37С, высокой влажности и 5-10% СО2.

2 этап. Учет роста. На двух чашках – рост менингококковых колоний: бесцветные, нежные, полупрозрачные, средних размеров, с ровными краями, гладкой поверхностью, вязкие. Сделали мазки из колоний, окрасили по Граму. В мазках – Гр- ярко-розовые, бобовидные диплококки. Для накопления чистой культуры используют тесты:

• Оксидазный и каталазный «+»

• Окисление сахаров посевом на 20% сывороточный агар с одним углеводом и с индикатором

• Посев на бессывороточный МПА

• Посев на 20% сывороточный агар с 0,2% желчи

Посевы в термостат при +37С на сутки.

3 этап. Учет дифференциальных тестов:

• Мальтоза +, сахароза -, лактоза -, фруктоза –

• На МПА бессывороточном роста нет

• На 20% сывороточнмо агаре с 0,2% желчи роста нет

Серогруппа определяется с помощью РА. Учет роста через 1-2мин – крупный хлопьевидный осадок.

Протокол №17. Подозрение на менингококковый гнойный менингит (Neisseria meningitidis серогруппы А).

1 этап. Взяли ликвор. Одна порция – постановка ПЦР, вторая порция засеяли на шоколадный агар с 20% сывороточным полужидким агаром, третья – бактериоскопия и серодиагностика. Посевы ставят в термостат при +37С, повышенной влажности и 5-10% СО2. Сделали 2 мазка: один окрасили метиленовым синим, второй – по Граму. В мазках диплококки бобовидной формы, часть из них расположена в нейтрофилах и Гр- диплококки. Латекс-АГГ для экспресс-диагностики ликвора – «+» результат в виде хлопьевидного осадка.

2 этап. Учет роста. На «шоколадном агаре» бесцветные, нежные, полупрозрачные, средних размеров, с ровными краями и гладкой поверхностью, вязкой консистенции. Из колоний сделали мазки по Граму в модификации Калины – Гр- ярко-розовые бобовидные диплококки в мазках. Для накопления чистые культуры отсеяли на скошенный сывороточный агар. Посевы поставили в термостат при +37С и повышенной влажности.

3 этап. Учет роста. На скошенном сывороточном агаре рост в виде сплошного полупрозрачного налета. Для проверки чистоты делали мазки по Граму. Произвели идентификацию чистой культуры тестами:

• Оксидазный и каталазный «+»

• Окисление сахаров посевом на 20% сывороточный агар с одним углеводом и с индикатором

• Посев на бессывороточный МПА

• Посев на 20% сывороточный агар с 0,2% желчи

Посевы поставили в термостат при +37С на сутки.

4 этап. Учет дифференциальных тестов:

• Мальтоза +, глюкоза +, сахароза -, лактоза –

• На МПА бессывороточном роста нет

• На 20% сывороточнмо агаре с 0,2% желчи роста нет

Определение серогруппы культуры в реакции-АГГ на стекле с помощью АГГ-сывороток против менингококков серогрупп А, В, С. На стекло (поделено на 3 части) нанесли физ. р-р. Далее отобрали культуры и суспендировали в каплях физ. р-р. После добавили антисыворотки А, В, С и перемешали (если нет спонтанной АГГ с физ. р-ром). Учет реакции через 1-2мин. Видно крупные хлопья в капле с сывороткой А и помутнение с сывороткой В, С.

Протокол №18. Подозрение на коклюш. (Bordetella pertussis серовариант 1.0.3).

1 этап. У больного на 2-й неделе заболевания сделали забор слизи с задней стенки глотки дважды ежедневно натощак. Посеяли материал на 2 чашки КУА: с добавлением селективного фактора и без. Материал втирали. Посевы поставили в термостат при +37С на 2-5сут с ежедневным просмотром.

2 этап. Учет роста. Через 72ч на КУА рост выпуклых, влажных, гладких, блестящих, с ровными краями, серые, жемчужного оттенка, мягкой консистенции колонии. При микроскопии видно «хвост кометы» от центра колонии. Для накопления чистой культуры пересеяли на пластинки КУА. Посевы поставили в термостат при +37С.

3 этап. Учет роста. на секторах КУА – сплошной серовато-жемчужный налет. В мазках – Гр- мелкие, овоидные палочки (коккобактерии), расположены равномерно. Для идентификации по АГ свойствам сделали постановку РА на стекле со специфическими неадсорбированными сыворотками (1:10):

• Коклюшная +

• Паракоклюшная +

С адсорбированными монорецептивными сыворотками:

• Факторная 1 +

• Факторная 14 –

Для определения сероварианта поставили РА с монорецепторными сыворотками:

• Факторная 2 –

• Факторная 3 +

Для изучения бх свойств сделали посев чистой культуры на среду с тирозином и с мочевиной, среду Симмсона. Для определения подвижности сделали посев «уколом» в полужидкий агар. Для определения роста на простых средах – на скошенный МПА. Посевы поставили в термостат при +37С на 1-2сут.

4 этап. Учет дифференциальных тестов:

• На МПА роста нет

• На среде с тирозином без изменения цвета

• На среде с мочевиной без изменения цвета

• На среде Симмонса без изменения цвета

Протокол №19. Подозрение на дифтерию (Corinebacterium diphtheria биовар gravis tox+).

1 этап. У больного взяли отделяемое зева и носа стерильным ватным тампоном натощак на границе пораженных и здоровых тканей миндалин. Материал посеяли на 2 сектора кровяно-теллуритового агара (КТА), маркируя: «зев», «нос».

2 этап. Учет роста. На КТА – R-формы, темно-серые, мелкие, шероховатые колонии в виде «маргаритки». Поставили диагностический тест – определение токсигенности (дифтерийного токсина) в иммунопреципитационном тесте Элека (РП в геле). Для этого одну половину колонии отсеяли на среду для определения токсигенности дифтерийных микробов (ОТДМ) и на среду Пизу для определения цистиназной активности. Другу половину – на скошенный сывороточный агар для накопления чистой культуры.

РП в геле по Элеку: на чашку Петри с ОТДМ поставили диски с дифтерийным антитоксином. Вокруг них образовалось 5 бляшек: 2 – контрольного токсигенного штамма С. diphtheria биовар gravis tox+, 3 – испытуемые.

3 этап. Учет теста Элека через 18-24ч и 48ч: между диском с антитоксином и испытуемой культурой образовались линии преципитации. Проба Пизу «+»: в столбике вокруг «укола» черно-коричневое облачко). Предварительный ответ: от больного выделена культура токсигенных коринебактрий. Для идентификации вида по бх свойствам посеяли чистую культуру на среды Гисса (с сахарозой, глюкозой, крахмалом) и сывороткой, а также в среду с мочевиной (уреазная активность). Посевы поставили в термостат при +37С на стуки.

4 этап. Учет дифференциальных тестов:

• Сахароза –

• Глюкоза +

• Крахмал +

• Уреаза –