3. Технология выделения и очистки декстранов

Повышенная вязкость среды делает невозможным отделение полисахарида от клеток продуцента из нативной культуральной жидкости. Поэтому при крупномасштабном производстве не производят удаления продуцента из культуральной жидкости, а пастеризуют ее нагреванием.

Продукт извлекают из культуральной жидкости относительно мягким и простым способом – осаждением органическим растворителем (спиртом). Таким образом, уменьшается вероятность разрушения или модификации полимера.

Однако нативный декстран не пригоден для использования в качестве плазмозамещающего средства, так как имеет очень большую молекулярную массу (ММ) (достигающую сотен миллионов дальтон), значительную вязкость, обладает токсическим действием и изменяет иммунореактивные свойства организма. Высокомолекулярные декстраны (более 150 тыс.) могут привести к агрегации крови. В тоже время препараты с ММ от 40 тыс. и ниже не увеличивают скорость агглюцинации. Поэтому с целью снижения ММ декстран подвергается частичному гидролизу. Можно при необходимости деполимеризовать выделенный декстран ферментативно, термической обработкой или ультразвуком. Из полученной смеси выделяют среднемолекулярную фракцию, очищают и на ее основе изготавливают лекарственную форму с заданным молекулярно-массовым распределением. По этому критерию плазмозамещающие средства на основе декстрана делят на две основные группы:

–        низкомолекулярные декстраны (ММ 30000–40000);

–        среднемолекулярные декстраны (ММ 50000–70000).

Осаждать фракции клинического декстрана с нужной ММ из смеси декстранов можно, используя определенные приемы. Так, например, более высокие концентрации спирта позволяют осаждать из раствора декстраны с меньшей ММ, декстраны же с большей степенью полимеризации осаждаются, напротив, при меньших концентрациях спирта.

Для очистки декстран неоднократно растворяют в воде, переосаждают спиртом и фракционируют. Для удаления нежелательных примесей используют также многократную обработку раствора активированным углем. При этом варьируют уровень рН, что способствует изменению растворимости различных присутствующих в растворе веществ.

Технология получения декстрана 40

Продуцентом декстрана 40 является культура Leuconostoc mesenteroides (факультативные анаэробы). На жидкой синтетической среде образуют капсулы углеводного происхождения.

Накопление посевного материала (ПМ) производят в два этапа:

1. Выращивание ПМ в пробирках. Массовая доля сахара в среде должна составлять 9,5±0,5%, рН – 6,6±0,2. Поддержание штамма в активном состоянии производят путем пересева культуры один раз в двое суток из пробирки в пробирку на свежеприготовленную среду.

2. Выращивание ПМ в колбах. Для выращивания ПМ в колбах вместимостью 1000 мл используют 30±6 часовую культуру Leuconostoc mesenteroides, выращенную в пробирках, в количествах 25±1 мл на каждую колбу. Состав среды аналогичный. Засеянную среду в колбах культивируют в течение 30±6 ч.

Ферментация. Питательная среда состоит из 10 компонентов: МgSO₄, КН₂РО₄, Na₂HPO₄, NH₄Cl, КCl, соль Мора

(FeSO₄×(NH₄)₂SO₄×6H₂O), парааминобензойная кислота, пептон, сахар и вода для инъекций.

Технологический процесс ферментации состоит из следующих стадий:

1. выращивание посевного материала в инокуляторе. Для засева инокулятора используют ПМ из колб в количестве 10% к объему среды в инокуляторе (3 колбы по 700 мл). ПМ в колбах должен соответствовать следующим требованиям:

а) внешний вид – мутная густая жидкость;

б) морфология культуры – цепочки кокков с капсулами; в) отсутствие посторонних микроорганизмов;

2. получение нативного декстрана в биореакторе.

Выделение и очистка продукта. Осаждают нативный декстран спиртом этиловым, затем растворяют в воде осадок нативного декстрана и переосаждают декстран спиртом этиловым. После чего растворяют очищенный декстран в воде и проводят гидролиз. Обрабатывают раствор частично гидролизованного декстрана непирогенным углем и фильтруют через аппарат для выделения высокомолекулярной фракции декстрана. Также отдельно выделяют среднемолекулярную фракцию. В последующем проводят стерилизацию. Выделяют первичную стерилизацию с активированным углем, фильтрацию и ионообменную очистку раствора декстрана 40 и вторичную стерилизацию раствора с активированным углем, фильтрацию, корректировку раствора декстрана 40.

Получение декстранов другими методами

Поскольку декстрансахараза в значительной степени выделяется в среду и синтез полимера идет вне клетки, декстраны получают и ферментативным путем. Для этого продуцент выращивается в условиях, обеспечивающих наиболее высокую активность внеклеточного ферментного комплекса. В период максимальной активности декстрансахаразы культуральную жидкость отделяют от клеток и консервируют, снижая значение рН до 5,0–5,2. При такой кислотности и температуре около 15°С декстрансахараза, содержащаяся в культуральной жидкости, сохраняет активность не менее месяца. Ферментационная среда должна содержать сахарозу и декстран-«затравку». Процесс синтеза продолжается около 8 ч. Ферментативный способ удобнее микробиологического, так как он поддается более надежному контролю и регулированию, позволяет одним только варьированием исходных концентраций сахарозы и фермента, а также температуры процесса сразу получать декстран необходимой ММ. Это значительно упрощает и удешевляет последующие технологические операции. Широкое применение в промышленности может найти использование иммобилизованных декстрансахараз.