Любому виду хроматографии присуща следующая методика:
Подготовка аппаратуры и реактивов.
Получение хроматограммы.
Анализ хроматограммы.
Хроматограмма представляет собой зависимость аналитического сигнала от времени или объема раствора, прошедшего через колонку.
Существуют три основных способа получения хроматограмм.
1. Фронтальная хроматография. Это простейший по методике вариант хроматографии. Он состоит в том, что через колонку с адсорбентом непрерывно пропускают анализируемую смесь разделяемых веществ.
Раствор, вытекающий из хроматографической колонки, называется эффлюентом.
Вследствие различной сорбции веществ сначала из колонки будет вытекать растворитель, а затем наступает насыщение сорбента наименее сорбируемым веществом, и это вещество появляется в эф-флюенте. Когда сорбент насытится вторым веществом, и это вещество появляется в эффлюенте, эффлюент содержит оба этих вещества. На третьем этапе эффлюент будет содержать три вещества и т.д. Таким образом, через некоторое время состав раствора при прохождении через колонку меняться не будет.
При фронтальной хроматографии можно отделить и получить в чистом виде лишь одно наименее сорбируемое вещество. Метод применяется, например, для очистки раствора от примесей, если они сорбируются существенно лучше, чем основной компонент, или для выделения из смеси наиболее слабо сорбирующегося вещества.
2. Элюентная (проявительная) хроматография. Хроматографическую колонку промывают элюентом – раствором вещества или растворителем, обладающим меньшей сорбируемостью, чем любое из разделяемых веществ. Затем в колонку вводят порцию анализируемой смеси, содержащей разделяемые компоненты, растворимые в элюенте. Объем раствора должен быть мал, чтобы разделяемые вещества сосредоточились в верхней части колонки. После этого через колонку непрерывно пропускают элюент (производят элюирование).
Элюирующая способность элюента различна в отношении компонентов смеси, и под действием элюента перемещение разделяемых веществ происходит с различными скоростями в соответствии с их сорбируемостью. Наименее сорбируемые вещества движутся быстрее и распределяются в нижней части колонки, наиболее сорбируемые – медленнее и располагаются в верхней части колонки.
На определенном этапе происходит полное разделение веществ на отдельные зоны, разделенные участками чистого сорбента. В газе или растворе, вытекающем из колонки, сначала появляется компонент, наименее сорбируемый, далее – чистый растворитель, а затем компонент, более сорбируемый.
Элюентный метод дает возможность полностью разделять сложные смеси, поэтому он более эффективен и наиболее часто применяется в практике. Недостатком метода является уменьшение концентрации выходящих растворов за счет разбавления растворителем или газом-носителем.
3. Вытеснительная хроматография. В этом методе анализируемую смесь компонентов вводят в колонку и промывают раствором вещества (вытеснителем), которое сорбируется лучше, чем любой из компонентов анализируемой смеси. По мере продвижения по колонке вытеснитель сначала вытесняет более сорбируемый компонент смеси, который в свою очередь начинает вытеснять менее сорбируемый компонент, тот в свою очередь вытесняет еще менее сорбируемый и т.д. В результате анализируемая смесь перемещается впереди фронта вытеснителя, и разделяемые вещества располагаются последовательно друг другом.
Концентрация раствора при хроматографировании не уменьшается, в отличие от элюентного метода. Существенным недостатком вытеснительного метода является возможное наложение зоны одного вещества на зону другого, поскольку зоны компонентов в этом методе не разделены зоной растворителя.
В жидкостной хроматографии подвижной фазой всегда является жидкость, а неподвижной фазой может быть жидкой, твердой или представлять собой гель. Обычно подвижная фаза проходит через колонку с неподвижной фазой только под действием силы тяжести, и процесс разделения занимает продолжительное время. Поэтому сконструированы приборы – жидкостные хроматографы, в которых используют колонки малого диаметра, а жидкость поступает под давлением. Этот метод называют высокоэффективная (высокоскоростная) жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая получила широкое применение и может конкурировать только с газовой хроматографией.