Mikrobiologie_ploha_1_nvody

Koncentrace methanolu [%]

Obr. 2 Příklad: závislost inhibice ůrstu Pseudomonas fluorescens na koncentraci methanolu (viz Obr. 1). Všimn ěte si, že nižší koncentrace zp ůsobují stimulaci růstu bakterií. Naměřená data jsou proložena logistickou křivkou.

Hodnota IC50 je nejvýznamn ější toxikologický ukazatel. Vyjad řuje koncentraci toxikantu, která způsobí snížení r ůstu bakterií právě o 50%. Hodnota IC50 se vypočítá, stejně jako případné další toxikologické ukazatele, regresí získaných dat. To lze ud ělat několika způsoby, např. 1) proložit experimentální koncentračně-inhibiční data nelineární regresí vhodnou rovnicí popisující sigmoidní k řivku. Hodnoty inhibic je také možné 2) přepočítat na tzv. probity dle tabulky (viz dále). Probity, pokud jsou vynesené do grafu proti logaritmu koncentrace, tvoří obvykle lineární závislost, kterou lze proložit nadnos lineární regresí a vypočítat hodnotu IC50.

Pozn.: Vychází-li záporné a nulové inhibice, kterýmodpovídá probit 0, pak je řteba počítat regresi jen s jedním, který má nejvyšší koncentraci . Naopak u 100% inhibic, kterým odpovídá probit 10, je třeba počítat jen s tím, který má nejnižší koncentraci.

Ad 1: Rovnic popisujících sigmoidu existuje celářada (Weibülova rovnice, Gompertzova funkce, Hillova rovnice atd.). Jako příklad bude dále využita tzv. logistická funkce (téžznámá jako Boltzmannova sigmoida) v mírně upraveném tvaru, kdy hodnota EC50 už je vyjádřena jako regresní parametr křivky:

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 52

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

Nelineární regrese sigmoidních křivek se v Excelu počítá poněkud složit ě, protože Excel nemá předdefinované sigmoidy na prokládánířivek v grafech. Je proto vhodné použít některý z dostupných program ů schopných po čítat nelineární regrese. Pro účely jednoho protokolu je možné např. stáhnout zkušební verzi balíku QCExpert odčeské firmy Trilobyte software (www.trilobyte.cz) nebo využít i n ěkteré programy s licencí freeware. Výhoda statistických balík ů je v tom, že vypo čítají regresní hodnoty i s p říslušnými intervaly spolehlivosti.

Ad 2: Probitová metoda byla vyvinuta ve 30. letech 20. století, aby umožnila linearizovat sigmoidní závislost a usnadnit tak výpočet i bez použití tehdy nedostupné výpo četní techniky. Je založena na teoretickém předpokladu, že citlivost jednotlivých jedinc ů testované populace k toxikantu má tzv. normální rozdělení. Probity představují inverzní funkce k distribuční funkci normálního rozdělení, kterou ale nelze vyjádřit analyticky (vzorcem), proto se používá tabulka resp. počítač.

Postup:

1.Pro každou hodnotu inhibice nalezn ěte v tabulce nejbližší probitovou hodnotu.

2.Pro každou koncentraci vypo čítejte její dekadický logaritmus.

3.Sestrojte graf, kdy na ose X budou logaritmy koncentrace a na ose Y zjišt ěné probity.

4.Hodnoty proložte lineární regresíprobit = kx + q (např. v Excelu funkcí „Spojnice trendu“ v grafu nebo Lin.regrese v datech).

5.Z regresní křivky vyjádřete x a vypočítejte hodnotu odpovídající probitové hodnotě 5 (probit 5 odpovídá 50% inhibici).

6.Z této hodnoty vypočítejte hodnotu IC50 = 10x

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 53

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

Tab. I Probitové hodnoty

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 54

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

12 Zadání praktických úloh

Konkrétní praktické úlohy pro vlastní laboratorní vicčení s důrazem na komplexní rozbory reálných vzorků z životního prost ředí.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 55

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

13 Teoretické úlohy k procvičování

Kapitola zaměřená na teoretické procvičování zejména vyhodnocování výsledků stanovení (zejména výpočtů) vhodná k procvičování (např. vyhodnocení kultivačních stanovení v podobě CFU/ml, přepočty dat z počítací komůrky, vyhodnocení testů toxicity). Část úloh bude modelově řešena.

13.1Výpo čty kultivačního stanovení

Při všech kultiva čních stanoveních se výsledky udávají jako CFU (colony forming units) popř. KTJ (kolonie tvořící jednotky, český ekvivalent) na jednotku výchozího materiálu (např. na ml v případě přírodní vody, na litr v případě pitné vody, na gram v případě půdy, na cm2 v případě stěrů z plochy apod.).

Při těchto výpo čtech se zpravidla vystačí s trojčlenkou, jen je třeba do matematické podoby převést manipulace se vzorkem a správně započítat objemy, ředění apod.

Příklad 1. (řešený) – výpo čet koncentrace kultivovatelných mikroorganism ů ve vzorku vody.

Zadání:Ve vzorku vody z jezírka byly kultivačně stanoveny počtu mikroorganismů. Voda byla zředěna desítkovým ředěním sterilním fyziologickým roztokem 10x-100x-1000x . a 0,1 ml bylo roztíráno na misky s PCA agarem. Po kultivaci narostly následující počty kolonií: neředěný vzorek nepo čitatelně mnoho – 10x ředěno 695 – 100x ředěno 95 – 1000x ředěno 8. Vypočítejte koncentraci kultivovatelných mikroorganism ů ve vzorku.

Řešení: K výpo čtu je vhodný jen výsledek z ředění 100x (95 kolonií). 695 kolonií u ředění 10x je více než horní limit (500 kolonií), výsledek by mohl být zkreslený vzájemným antagonismem jednotlivých kolonií. Naopak 8 kolonií u ředění 1000x je příliš nízká hodnota (dolní limit pro výpo čet je 30 kolonií), výsledek by byl p říliš nep řesný. Budeme tedy po čítat jen s hodnotou 95 kolonií (dále už jen CFU).

Nejprve si vypočítáme koncentraci mikroorganismů v 1 ml zředěné suspenze (přímá úměrnost):

0,1 ml……………………………………...95 CFU

1 ml………………………………………..x

x = 1 / 0,1 x 95 = 10 x 95 = 950 CFU / ml.

Dále jeřteba násobit faktorem zředění.

x = 100 x 950 = 95 000 CFU / ml

Závěr: Ve vzorku vody z rybníka bylo zjišt ěno 95 000 CFU / ml kultivovatelných mikroorganimů.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 56

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

Příklad 2. (řešený) – výpo čet koncentrace kultivovatelných mikroorganism ů ve vzorku vody.

Zadání:Ve vzorku vody z bazénu byly kultivačně stanoveny počtu mikroorganismů. Voda byla zředěna desítkovým ředěním sterilním fyziologickým roztokem 10x-100x-1000x . a 0,2 ml bylo roztíráno na misky s PCA agarem. Po kultivaci narostly následující počty kolonií:

10x ředěno 348 – 100x ředěno 39 – 1000x ředěno 4. Vypočítejte koncentraci kultivovatelných mikroorganismů ve vzorku.

Řešení: K výpo čtu jsou vhodné jen výsledky z ředění 10x a 100x; 4 kolonie u ředění 1000x je příliš nízká hodnota (dolní limit pro výpočet je 30 kolonií), výsledek by byl p říliš nep řesný.

Ředění 10x

0,2 ml……………………………………... 348 CFU

1 ml………………………………………..x

x = 1 / 0,2 x 348 = 5 x 348 = 1 740 CFU / ml.

Dále jeřteba násobit faktorem zředění.

x = 10 x 1 740 = 17 400 CFU / ml.

Ředění 100x

0,2 ml……………………………………... 39 CFU

1 ml………………………………………..x

x = 1 / 0,2 x 39 = 5 x 39 = 195 CFU / ml.

Dále jeřteba násobit faktorem zředění.

x = 100 x 195 = 19 500 CFU / ml.

Na závěr z obou výsledk ů vypočítáme průměr (18 450) a směrodatnou odchylku (1485)

Závěr: Ve vzorku vody z bazénu bylo zjištěno 18 450 ± 1485 CFU / ml kultivovatelných mikroorganimů.

Příklad 3. (řešený) – výpo čet koncentrace kultivovatelných mikroorganism ů ve vzorku pitné vody.

Zadání: Vzorek pitné balené vody (250 ml) byl řpefiltrován přes sterilní filtr. Filtr byl obtisknut na misku s PCA. Po kultivaci narostlo 83 kolonií. Vypočítejte koncentraci mikroorganismů ve vodě.

Řešení: Každá kolonie odpovídá jednomu mikroorganismu ve vzorku, řešení je tedy jednoduchá trojčlenka.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 57

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

0,25 litrů……………………………..83 CFU

1 litr………………………………….x

x = 1 / 0,25 x 83 = 4 x 83 = 332 CFU / l

Závěr: Ve vzorku balené vody bylo zjištěno 332 CFU / ml kultivovatelných mikroorganism ů

13.2Výpo čty mikroskopických stanovení

V těchto případech se obvykle pracuje s počítací komůrkou. Je třeba si vždy zaznamenat jaké rozměry daná komůrka má (hloubka, plochačtverce). Pokud se pracuje se zahušt ěným nebo naopak ředěným roztokem, je t řeba zahrnout do výpo čtu i příslušné ředění. Pokud jsou počty mikroorganismů v jednotlivých čtvercích dostatečně vysoké, je možné výsledky i statisticky zhodnotit (průměr ± směrodatná odchylka).

Příklad 4. (řešený). Výpo čet koncentrace řas pomocí počítací komůrky typu Cyrus.

Zadání: Koncentrace řas ve vodě byla stanovena přímým po čítáním s využitím počítací komůrky typu Cyrus (hloubka 0,1 mm, plocha čtverce 1/16 mm2). Ve 20 čtvercích bylo celkem napočítáno 58řas. Vypočítejte koncentraci řas v 1 ml vody.

Při práci s počítací komůrkou pozorujeme vždy p řesně definovaný (malý) objem, ve kterém je zjišt ěna přesná koncentrace mikroorganismů. Vlastní výpo čet tedy sestává zřevodup jednotek a jednoduché trojčlenky.

Nejprve vypočítáme pozorovaný objem: V = 1/16 x 20 x 0,1 = 0,125mm3

Výsledek je v zadání žádán vyjádřit na 1 ml, 1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3

Sestavíme trojčlenku:

0,125 mm3…………………………………….58 řas

1000 mm3……………………………………...x

x = 1000 / 0,125 * 58 = 8000 * 58 = 464 000 řas / ml

Závěr: Ve vzorkuvody bylo zjišt ěno 464 000 řas / ml.

Příklad 5. (řešený). Výpo čet koncentrace řas pomocí počítací komůrky typu Cyrus.

Zadání: Abundance (výskyt) krásnooček rodu Euglena ve vodě z nádrže byl zjišťován přímým po čítáním pomocí počítací komůrky. 10 ml vzorku bylo nejprve zahušt ěno centrifugací, po slití supernatantu zůstal ve zkumavce objem 0,2 ml, ve kterém byly sedimentované mikroorganismy resuspendovány. S využitím počítací komůrky typu Cyrus I (hloubka 0,1 mm, plocha čtverce 1/16 mm2) bylo v 10 řadách (10x40 = 400 čtverců) napočítáno celkem 152 krásnooček. Vypočítejte koncentraci krásnooček v 1 ml vody.

Řešení:

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 58

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

Nejprve vypočítáme pozorovaný objem: V = 1/16 x 400 x 0,1 = 2,5mm3

Výsledek je v zadání žádán vyjádřit na 1 ml, 1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3

Nakonec započítáme zahuštění vzorku na centrifuze (pozorujeme koncentrovanou suspenzi, tj. výsledek je t řeba faktorem zahušt ění vydělit):

Faktor zahušt ění = 10 / 0,2 = 50

x = 60 800 / 50 = 1 216

Řešení 2: Pro rutinní výpo čty je vhodné využít už odvozenou rovnici pro kom ůrku Cyrrus I a odstředění objemu 10 ml (viz kapitola 7.1)

f = (K/n) · v · 10

f = (1600 / 400) x 0,2 x 10 = 8

Tímto faktorem se vynásobí napočítaný po čet mikroorganismů a získá se koncentrace v 1 ml x = 8 x 152 = 1 216

Závěr: V nádrži bylo zjištěno 1 216 krásnooček rodu Euglena v 1 ml vody.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 59

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

14 Přehled médií a roztoků

Tato kapitola uvádí přehled roztoků, pufrů, živných médií apod. z celých návodů..Pro větší přehlednost jednotlivých úloh je ale jejich příprava uvedena i přímo v návodech pro jednotlivé úlohy a stanovení.

14.1 Kultivační média

Všechna tekutá média je možné ztužit agarem o koncentraci 1-2 (10-20 g/l). Není-li uvedeno jinak, zpravidla se sterilují autoklávováním (0,1 MPa, 15 min, 115°C).

14.1.1 LB (Luria Broth)

Bohaté médium pro kultivaci bakterií.

pH se upravuje před autoklávováním na 7,2 ± 0,2.

14.1.2 Plate count agar (PCA)

Bohaté médium využívané ve ztužené podobě při kultivačních stanoveních heterotrofních mikroorganismů.

14.1.3 Malt extract

Bohaté médium vhodné pro kultivaci mikroskopickýchhub.

pH se upravuje na 7,2 ± 0,2.

14.1.4 Škrobový agar

Ve ztužené podobě se používá pro kultivaci amylolytických bakterií, např. bacilů.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 60

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

Škrob 10 g/l

pH se upravuje na 7,0 ± 0,2.

14.1.5 Médium pro kultivaci sladkovodníchřas

Mírně upraveno podle ČSN EN ISO 8692 a podle chemikálií dostupných na FŽP

Roztok 1 – Makrosložky živin

Roztok 3 – stopové prvky

Zde je odchylka od normy, z roztoku 3 jsou vyjmuty nejméně zastoupené stopové prvky a jsou vyčleněny do samostatného koncentrovanějšího roztoku 5

Roztok 5 – ostatní stopové prvky

Odchylka proti normě – místo ZnCl 2 je ZnSO4

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD