Mikrobiologie_ploha_1_nvody

S t r á n k a| 21

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

3. Z předchozího proměření 20× objektivu víme, že 1 dílek m ěřicího okuláru odpovídá 3,57 µm. Toto číslo použijeme pro výpo čet výsledné velikosti (ší řky, délky) pozorovaného objektu (rozsivka Diatoma vulgaris). V tomto případě, 19 × 3,57 µm, délka schránky pozorovaného objektu je 67,8 µm.

Poznámka:

Velikost pozorovaných objekt ů větších rozm ěrů, např. mikromycety, vláknité bakterie,řasy, sinice, apod., ne detaily (!), lze zjistit přibližn ě za použití po čítacích komůrek, např. typu

CYRUS I., která se v praxi používá velmičasto Počítací mřížka této komůrky je rozdělená na čtverečky (250 × 250 μm, 125 × 125 μm) a obdélníčky (125 × 250 μm), velikost délek je při

používání různých objektiv ů konstantní. Znalost těchto parametrů je vhodná při zjiš ťování velikostních kategorií vloček, dále organismů menších než 100 μm. Použití po čítacích komůrek, viz text dále.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 22

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

6 Mikrobiologické metody

Kapitola rozebírající detailněji obecné mikrobiologické metody a jejich použití při analýze přírodních vzorků.

6.1 Kultivační techniky

Principy kultivačních metod, obecná a selektivní média, kultivační stanovení a jejich vyhodnocení. Návody jednoduchých i víceméně náročných metod kultivace. Kontrola správnosti připravené půdy.

6.1.1 Stanovení Citlivosti mikroorganismů k antibiotikům

Oblast použití: Tato metoda platí pro stanovení citlivosti mikroorganismů (vybraných kmen ů) k antibiotikům.

Antibiotika jsou heterogenní skupinou chemických látek vykazující více či méně negativní účinky na organismy (bakterie, plísně, kvasinky, vyšší organismy), všeobecn ě využívané k potlačení růstu nežádoucích mikroorganismů. Spektrum a mechanismus působení antibiotik je velmi variabilní, organismy vystavené působení antibiotika tak mohou být ozna čeny za citlivé nebo rezistentní.

Podstata zkoušky

Citlivost mikroorganismů k antibiotikům se testuje na základě standardní diskové difúzní metody. Zkoušený objem kmenu mikroorganismu se rovn oměrně naočkuje na povrch živného média. Na zaschlé, mikroorganismem naočkovaný povrch média, se přenesou papírové disky napušt ěné antibiotiky. Naočkované misky s disky antibiotik se kultivují při 36 °C ± 2 °C po dobu 24 h až 36 h. Po skon čení kultivace se zjiš ťuje citlivost mikroorganismu k antibiotikům na základě velikosti inhibiční zóny v milimetrech, která se kolem disku vytváří (minimální inhibiční koncentrace, tzv. MIC).

Chemikálie

Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost.

Müller-Hinton ův agar

K přípravě pevného kultivačního média se používá komerčně vyráběné dehydratované médium od firmy Hi Media. (Složení: hov ězí výtažek … 300 g, hydrolyzát kaseinu … 17,5 g, šk rob …1,5 g, agar …17,0 g) P ři přípravě se dodržuje návod výrobce.

Výrobcem p ředepsané množství dehydratovaného média se rozpustív předepsaném množství demineralizované vody, po nabobtnání se sterilizujeautoklávováním 121 °C. Hotové médium

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 23

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

se po ochlazení asi na 50 °C vylévá do sterilních Petriho misek. Po ztuhnutí se misky skladují

v chladničce ve tmě.

Roztok 0,5% TTC

Tento roztok se používá pro potřeby zvýrazn ění inhibiční zóny. K 1 000 ml p řipravené půdy

se přidá 1 ml 0,5% vodného roztoku trifenyl tetrazoliumchlorid (TTC). Po jeho přidání do

agaru se růst projevuje červeným zabarvením.

Ředící roztok (fyziologický roztok)

(Složení: chlorid sodný … 9,0 g a demineralizovaná voda do 1 000 ml)

Po rozpušt ění chloridu sodného v demineralizované vodě se roztok doplní na objem do 1 000 ml. Po rozplnění do lahviček po 9 ml (k přípravě desetinného ředění) se část ponechá v baňkách na 250 ml (proředění při membránové filtraci). Vše se sterilizuje v autoklávu při 121 °C ± 3 °C po dobu 20 min. Skladuje se v chladni čce při teplotě 4 °C ± 2 °C nejdéle 1 měsíc.

Čisté kultury mikroorganismů

Želatinové disky testovaných mikroorganism ů, ze sbírky CCM, se rozpustí ve fyziologickém roztoku. Po promíchání se lahvička s rozpušt ěným diskem s mikroorganismy kultivuje v termostatu při teplotě 36 °C ± 2 °C po dobu 24 h.

Přístroje a pomůcky

Pipety s možností aplikace objemu 0,1 a 0,2 ml, jed norázové špičky, pinzety, skleněná roztírací tyčinka (Drigalskiho), kahan, kalibrovaný teplom ěr nebo teploměr porovnaný s kalibrovaným, analytické váhy citlivost 0,01 g, autokláv (121 ±) 3°C, horkovzdušný sterilizátor (160 ± 2) °C, Erlenmayerovy láhve, odměrný válec 100 ml, lahve se šroubovým uzávěrem, sterilní plastové Petriho misky o průměru 90 mm, disky s antibiotiky.

Postup zkoušky

Na povrch Müller-Hintonova agaru v Petriho miskách se napipetuje 0,1 (0,2) ml kultury testovaného mikroorganismu, naaplikovaný objem se rozetře po povrchu agarového média tak, aby rovnoměrně pokryl povrch. (Agarové médium by mělo být p ředsušené a zbavené nadbytečné vlhkosti.)

Po zaschnutí testované kultury mikroorganismu se sterilně přenesou na povrch média

testovací disky napušt ěné antibiotiky o známém složení a koncentraci. Na ovrchp jedné

Petriho misky s médiem lze umístnit maximálně 6 disků s antibiotiky.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 24

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

Probíhá inkubace vzorku po dobu 24 až 36 h v termostatu v při teplotě 37 °C.

Vyhodnocení zkoušky

Při kultivaci se z disku, napušt ěném antibiotiky, vypouští účinné látky, které difundují do agarového média. Na okraji zóny koncentrace antibiotika představuje minimální inhibiční koncentraci (MIC).Koncentrace látky ve směru os okraje postupně slábne. Účinné antibiotikum vytvoří kolem disku průzračnou zónu (bez nárůstu buněk).

Vyhodnocením účinnosti antibiotika na vystavený mikroorganismus se udává jako ůprměr vytvořené zóny v mililitrech. Zjišt ěné velikosti se zaznamenají do protokolu. Pro potřeby zjišt ění citlivosti či rezistence k antibiotikům lze použít p řiloženou tabulku.

Obecně však platí následující:

Pro citlivý mikroorganismus je typická velikost zóny v rozmezí 5 až 10 mm. Velmi citlivý mikroorganismus má charakteristickouvelikost zóny více než 12 mm.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

6.2 Biochemické metody

Přehled metod založených na stanovení biochemických m arkerů.

6.3 Metabolické metody

Přehled metod založených na sledování metabolických p rojevů mikroorganismů, enzymových aktivit včetně extracelulárních enzymů, respirace, denitrifikace apod.

6.4 Genetické metody

Přehled základních genetických metod a jejich aplikace při analýze mikroorganism ů v životním prost ředí včetně metod pro analýzu spole čenstev.

6.5 Metody identifikace mikroorganismů

Základní principy identifikace mikroorganismů jak známých tak i nových izolátů.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 26

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

6.6 Metody uchovávání mikroorganismů

Přehled hlavních metod pro dlouhodobé uchovávání mikrobiologických kultur.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 27

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

7 Mikrobiologické rozbory vod

Přehled používaných metod pro mikrobiologické rozbory všech druh ů vod. V úvodu budou rozebrány základní principy a dále pak uvedeny konkrétně přesné postupy s důrazem na normované a v praxi využívané uzanční metody (organotrofní organismy, indikátory fekálního znečišt ění).

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 28

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

7.1 Stanovení mikroskopického obrazu (biosestonu a abiosestonu)

Oblast použití: Metoda se používá pro stanovení mikroskopického obrazu a abiosestonu ve vodě.

Zkouška se používá ke zjištění jakosti povrchové (podzemní) vody, pitné vody, vprůběhu úpravy a po úpravě při akumulaci a distribuci.

Rušivé vlivy: Stanovení mikroskopického obrazu ruší větší množství suspendovaných nerozpušt ěných látek.

Stanovení abiosestonu (pokryvnosti) ruší vyšší obsa h živých organism ů.

Podstata metody

Metoda stanovení mikroskopického obrazu je založena na taxonomickém určení druhů, popř. vyšších taxonomických skupin, a po čtů těchto mikroorganismů ve vzorku zahušt ěném centrifugací pod mikroskopem s fluorescenční lampou.

Metoda stanovení abiosestonu je založena na stanove ní pokryvnosti zorného pole mikroskopu částicemi zahuštěnými odst ředěním vzorku vody.

Chemikálie

Během rozboru se používá demineralizovaná voda pro řípadnéředění vzorků a pro čišt ění komůrek. Pro promytí centrifugačních zkumavek se používáčistý ethanol.

Pro případné nejasnosti při taxonomickém určování Lugolův roztok.

Lugolův roztok

1 g jodu a 2 g jodidu draselného se rozetře v třecí misce s vodou a doplní do 300 ml. Roztok uchováváme v tmavé láhvi.

Přístroje a pomůcky

Binokulární mikroskop s přídavným fluorescen čním zařízením, laboratorní odstředivka s výkyvným rotorem, centrifugační zkumavky konicky zúžené s ostrou špičkou o objemu 10 ml (s kalibrací na 0,2 ml, 0,5 ml, 1 ml a 10 ml), počítací komůrka typu Cyrus I. (mřížka složená ze základníchčtverců o velikosti 250 × 250 μm umístěných ve 40 řadách ve vodorovném i ve svislém směru, tj. celkem

(mikropipetky), kádinka s demineralizovanou vodou,preparační jehla, jednorázové ubrousky.

Odběr, úprava a uchovávání vzorků

K odběru se používají sklen ěné nebo PE předem vymyté lahve o objemu 100 ml až 300 ml. Druh odběru, místo a bod se řídí účelem rozboru a místními podmínkami. Odebraný vzorek musí reprezentovat jakost vody v místě odběru. Odběr vzorku povrchové vody je dán možnostmi a dostupností k vytipovanému vzorkovacímu místu.

Při odběru z potrubí se stagnující vodou je pot řeba nechat vodu 5 min odtéct. Při odběru z čerpacího zařízení a dalších nezabezpe čených podzemních zdroj ů pitné vody je potřeba zajistit, aby se do vzorku nedostaly usazeniny ze dna.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 29

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

Vzorek pro stanovení se odebere do lahvičky, která se vypláchne odebíranou vodou a poté seaplní vzorkem do 4/5 objemu.

V laboratoři se vzorky skladují v chladu a temnu v lednici a zpracovávají se maximálně do 24 h od doby odběru.

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD

S t r á n k a| 30

Příloha MIKR-1 – Pracovní verze, ur čená k ověření a evaluaci při výuce 2012/2013

Postup zkoušky

Do centrifugační zkumavky se odměří 10 ml promíchaného vzorku a po dobu 5 min se odstřeďuje

-1

v centrifuze, o průměr rotoru 0,08 m, při otáčkách 2 000 ot.min (při použití jiného typu odstředivky se musí velikost otáček přepočítat). Po odstředění se vzorek slije tak, aby sediment zůstal ve zkumavce. Vodu ulpěnou na stěnách zkumavky spojíme se zbytkem tak, že provedeme opakovanou centrifugami vzorku. Poté už vzorek nesléváme. Vzorek se opatrně promíchá a kapka se přenese mikropipetkou do počítací komůrky.

Stanovení biosestonu. Pod mikroskopem se určí druhy nebo taxonomické skupiny a vyjádří se jejich počet. Počet se zjiš ťuje na ploše celé komůrky nebo na určitém počtu pruhů. Při práci s komůrkou typu Cyrus I. se pro vyhodnocení počtu jedinců v 1 ml vzorku vody používají p řepočítávací koeficienty f() podle toho, kolik pásů komůrky se vyšet ří a na jaký objem se vzorek odst ředil (viz rovnice 1).

Při práci s komůrkou typu Cyrus II. se pro vyhodnocení počtu jedinců v 1 ml vzorku vody používají přepočítávací koeficienty f() podle toho, kolik pásů komůrky se vyšet ří a na jaký objem se vzorek odstředil (viz rovnice 2).

Při rozborech se používá fluorescenční lampa ke zjišt ění životaschopnosti mikroorganism ů. Podstatou vitality je autofluorescence asimilačních pigmentů v buňce, kdy živé buňky září pod fluorescencí červeně.

Stanovení abiosestonu. V případě stanovení abiosestonu se při 200 násobném celkovém ězvtšení mikroskopu porovná pokrytí zorného pole s odhadovoustupnicí (viz obr. 1). Tímto způsobem se zjistí celková abundance abiosestonu.

Pro potřeby detailnější analýzy je pot řeba zjistit typ alochtonních či autochtonních částic abiosestonu (např. dle obr. 3) a u jednotlivých typ ů částic je vhodné uvést i jejich abundanci (hojnost)Hojnost. částic lze uvádět slovně či číselně. Stupně hojnosti: 1 (ojediněle, pod 1 %), 2 (roztroušen ě, 1 % - 3 %), 3 (řídce, 3 % - 10 %), 5 (hojně, 10 % - 20 %), 7 (velmi hojně, 20 % - 40 %) a 9 (hromadně, nad 40 %).

CZ.1.07/2.2.00/28.0205 - ENVIMOD