намические аспекты процесса локального раскрытия двойной спирали ДНК. Какую модель выбрать? Мы могли бы начать с простейших мо­ делей первого уровня. Однако эти модели не являются подходящими, поскольку они вовсе не учитывают внутреннюю структуру ДНК. Моде­ ли второго уровня более подходящие, и они могут быть использованы в качестве первого приближения. Модели третьего уровня более точные, и их применение позволило бы описать процесс более детально. Такие модели можно рассматривать как второе приближение и т. д.

2.8.Экспериментальные методы изучения динамики ДНК

Известно много различных экспериментальных методов изучения внутренней динамики ДНК. Наиболее важными из них являются ме­ тоды рамановского рассеяния [149-152], рассеяния нейтронов [153— 155], инфракрасной спектроскопии [156,157], водородно-дейтериевого (- тритиевого) обмена [15,158], микроволнового поглощения [159-161], ЯМР [162-165], переноса заряда [166-174] и манипулирования отдель­ ной молекулой [66,175,176,178]. В этом разделе мы опишем кратко каж­ дый их них.

2.8Д. Раман-спектроскопия

Методы неупругого рассеяния на ориентированных пленках извест­ ны как методы рамановского рассеяния. Они дают значительный вклад в понимание динамики ДНК. Низкочастотная область рамановского спектра представляет наибольший интерес, поскольку ее структура за­ висит от внутренних движений жестко связанных атомных групп (на­ пример, оснований), слабо связанных друг с другом. Частоты, представ­ ляющие наибольший интерес, расположены в области между 0.003 см-1 и, возможно, 100 см-1 (от 1 Ггц доЗ Тгц или во временной шкале от 1 нсек, до ~0.3 псек).

Существуют, однако, некоторые трудности в получении и интерпре­ тации спектральных линий. Существует также много трудностей в те­ оретических вычислениях рамановских интенсивностей. Теоретические предсказания существенно разнятся даже для «простых» молекул типа бензола. Таким образом, можно ожидать, что для ДНК возможны толь­ ко качественные расшифровки наблюдаемых данных. Один из примеров такой расшифровки был дан в работах Урабе и Томинага [179] и Демарко

и соавторов [180], где наблюдалось смягчение рамановской моды вблизи 25 см-1 в TVa-ДНК. Было замечено, что такое смягчение существен­ но возрастает при таких значениях относительной влажности, при кото­ рых рентгеновские снимки показывают переход из А- в В-конформацию. Таким образом был сделан вывод о том, что низколежащие рамановские полосы должны быть связаны с А —>В-конформационным сдвигом в ДНК.

Схематическое изображение эксперимента показано на рис. 2.10. Для сохранения волнового вектора требуется, чтобы внутреннее дви­ жение (например, малоамплитудное колебание атомной группы, которая рассеивает свет на угол а) имело волновой вектор к , равный изменению (ki —ks) в волновом векторе света.

Рис. 2.10. Схема эксперимента по неупругому рассеянию лазерного света. Спек­ тральные компоненты, WL ±Wf(k), разделяются спектрометром и регистриру­ ются с периодически повторяющимся сканированием при помощи компьютера, усредняющего сигнал. Здесь а —рассеивающий угол внутри образца; к = h —ke

Согласно рис 2.10, величина к (к = |fc|) дается формулой

где п — показатель преломления образца, г Хь — длина волны лазера. Для выполнения закона сохранения энергии необходимо, чтобы рассе­ янный свет содержал следующие компоненты:

где Wf (к) — собственные значения так называемой матрицы ДНК, ко­ торые будут обсуждаться подробно в главе 4.

Даже если величина к хорошо определена, эти компоненты появля­ ются в спектре как расширенные пики с шириной, которая определяет время жизни колебания. Поскольку наибольшее значение к равно Атт/Хь, рассеяние ограничено модами вблизи центра зоны. Таким образом, сдви­ ги центра зоны продольной и вращательной мод будут определять ско­ рость звука при помощи соотношения V = Wf/k. Так как дисперсия изгибной моды квадратична, то соответствующий сдвиг центра зоны, по-видимому, будет слишком мал, чтобы можно было его наблюдать. Что касается сдвигов оптической, резонансной и локальной мод, то они не зависят от к.

Обычно экспериментаторы работают с образцами, состоящими из ориентированных волокон. В этом случае можно ожидать, что в раство­ ре продольные (распространяющиеся вдоль волокон) акустические моды будут быстро затухать. Волокна позволяют также легко контролировать конформацию, и в принципе можно извлечь многое из знания ориента­ ции вектора к относительно оси волокна.

2.8.2. Рассеяние нейтронов

Тепловые (или медленные) нейтроны с длиной волны Де Бройля между 2 и 2 0 А являются универсальным инструментом исследования динамики ДНК. Они имеют энергии между 20 и 0.2 Мэв, в сравнении с энергией рентгеновских лучей « 10 кэв. По этой причине с помо­ щью нейтронов можно выйти за пределы дифракции и сделать нечто такое, что невозможно сделать при помощи рентгеновских лучей: про­ вести энергетический анализ интенсивности, записанной для каждого рассеивающего угла, в дополнении к измерениям ее зависимости от угла.

Геометрия задачи рассеяния показана на рис. 2.11. Направление рас­ пространения рассеянного нейтрона по отношению к падающему нейтро­ ну определяется полярным углом в и азимутальным углом <р. Если поток падающих нейтронов, определяемый как число нейтронов на единицу площади и в единицу времени, равен N, то число нейтронов, рассеян­ ных за единицу времени в элемент телесного угла Q = sinQdQdUp, равно

где (da/dQ,) — дифференциальное сечение рассеяния.

Основные уравнения сохранения, определяющие взаимодействие между квантом падающего излучения и рассеивающим центром, име-

где hx и hw — передача момента и энергии соответственно (h — посто­ янная Планка/27г). Начальный и конечный волновые векторы и энергии обозначены как к'у к" и Е'уЕ"

Часть падающего потока нейтронов обычно рассеивается упруго. Это так называемое упругое рассеяние, которое характеризуется соот­ ношением к' = к" (к' = |fc'|, к" = \к"\). Оно дает не зависящую от х ди­ фракционную картину, которая при помощи Фурье-преобразования свя­ зана с реальной пространственной структурой.

Другая часть падающего потока нейтронов рассеивается неупру­ го, то есть она будет обмениваться энергией с тепловыми колебаниями и другими возбуждениями в образце. Именно это неупругое рассеяние несет в себе информацию о внутренних движениях в ДНК.

За исключением спин-эхового инструментария, все нейтронные спектрометры выдают результат в виде двойного дифференциального сечения, cPa/dTldE' В простейшем случае моноатомного ансамбля рас­ сеивающих ядер двойное дифференциальное сечение определяется фор­