Тема 19. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ (фармакокинетические исследования лекарственных средств)

Успехи современных физико-химических методов анализа определили становление и развитие фармакокинетики – относительно новой науки изучающей судьбу лекарственных средств (ЛС) в организме. В первую очередь предметом изучения фармакокинетики является исследования процессов всасывания, распределения в различных органах и тканях и связывния с белками ЛС.

Количественное определение ЛС в биологических жидкостях является основным этапом фармакокинетических исследований ЛС. Необходимость этих исследований возникает в различных ситуациях:

¾ проведение «терапевтического лекарственного мониторинга» − регулярного контроля за концентрацией ЛС в плазме крови в процессе проведения фармакотерапии (особенно для препаратов с узким терапевтическим диапазоном дигоксин, гентамицин, теофиллин, карбамазепин и другие). При этом основной задачей фармакокинетики являются обоснованные рекомендации в отношении режимов назначения препаратов, величин поддерживающих доз и периодичности приема, которые обеспечивали бы быстрое достижение и длительное поддержание концентрации ЛС в пределах терапевтического диапазона;

¾ фармакокинетические исследования новых ЛС − доклинические исследования на животных (определение динамики концентрации после введения в терапевтических дозах, определение токсических концентраций и другое), клинические исследования (определение динамики концентрации у здоровых добровольцев − I фаза, у пациентов с соответствующей патологией после однократного и на фоне курсового приема − II фаза, пострегистрационные исследования);

¾исследования по биоэквивалентности воспроизведенных (генерических) ЛС (определение динамики концентрации после однократного приема ЛС у здоровых добровольцев или в некоторых случаях крупных видах животных в сравнении с оригинальным препаратом);

¾при изучении особенностей метаболизма ЛС, факторов влияющих на него и при изучении взаимодействия ЛС в условиях организма;

¾при разработке и проведении лекарственных тестов для оценки функции органов и систем (кофеиновый тест, MEGX - тест, эритромициновый тест и другие).

626

Таким образом, исходя из выше сказанного понятно, что определение концентраций ЛС в биологических жидкостях является важной задачей не только при подборе оптимальной схемы дозирования, но и в других ситуациях.

Определение ЛС в биологических жидкостях включает в себя следующие стадии:

1)отбор проб и их хранение. Чаще всего определение ЛС проводят в крови (цельной, плазме или сыворотке крови), также бывает необходимо анализировать содержание ЛС в слюне, моче, реже спинномозговой или внутрисуставной жидкости. Время отбора проб после приема анализируемого ЛС определяется задачами исследования. Количество жидкости отбираемое для исследования должно обеспечивать два определения (в слу-

чае если возникнет необходимость повторного измерения). Хранятся пробы в замороженном виде при температуре от -180С и ниже. Так, например при температуре -350С 90 % ЛС могут храниться без изменения содержания в течение 6 месяцев. Незначительное число ЛС требуют еще более низкой температуры хранения или не хранятся и должны анализироваться сразу после отбора проб. Пробы могут быть заморожены только один раз. Разморозка, повторная заморозка и затем опять разморозка для анализа недопустимы. Поэтому рекомендуется одну пробу разливать и хранить в двух пробирках: одна берется для анализа, а вторая остается в морозилке для повторного анализа этой пробы в случае необходимости. Все пробы должны иметь четкую, подробную маркировку;

2)выбор метода количественного определения и подбор условий анализа. Для получения достоверных результатов важное значение имеет правильный выбор метода количественного определения ЛС в биологической жидкости, который зависит от химических свойств вещества и задач исследования. Подбор условий анализа может включать выбор аналитической длины волны, состава подвижной фазы и другие в зависимости от метода;

3)изолирование (выделение) ЛС из биологической жидкости с последующим концентрированием. Для этой цели используют твердо-фазную или жидко-фазную экстракцию ЛС из биологической жидкости. Условия экстракции полностью определяются химическими свойствами ЛС. Для твердо-фазной экстракции используют патроны с различными сорбентами (типа Sep-Pak или другие). Жидко-фазная экстракция, как правило, осуществляется органическими экстрагентами (хлороформ, эфир, гексан и другие) в необходимой кислой или щелочной среде. Так, например, диклофенак натрия является производным о-аминофенилуксусной кислоты, его рКа = 4.0, следовательно, для эффективной экстракции из плазмы крови необходима кислая реакция среды и рН=2.0, что достигается добавлением

627

к пробе 200 мкл 1M раствора о-фосфорной кислоты. Реже используются и другие способы выделения ЛС, например, осаждение белков 30% раствором НClO4. Концентрирование ЛС достигается путем либо упаривания экстрагента до сухого остатка, который растворяется в нескольких микролитрах растворителя, либо путем реэкстракции;

4)собственно количественный анализ. Как правило, проводится методами абсолютной калибровки или внутреннего стандарта;

5)обработка результатов. В зависимости от поставленной цели исследования проводится статистическая обработка результатов в соответствии

сзадачами исследования, расчет фармакокинетических параметров, расчет оптимального режима дозирования, обсуждение результатов.

Методы, используемые для определения ЛС в биологических жидкостях

Основным фактором, отличающим определение ЛС в биологических жидкостях от их определения в фармацевтических препаратах и других продуктах, является низкое содержание ЛС в пробе (чаще нг/мл, реже несколько мкг/мл, а иногда пг/мл), а также присутствие в пробе большого числа эндогенных соединений или других ЛС, что и определяет повышенные требования к методам анализа.

В целом избранный для количественного определения ЛС в биологических жидкостях метод должен иметь высокую чувствительность, возможность работы с малыми объемами проб, большую специфичность и избирательность, отличаться точностью и воспроизводимостью, универсальностью (пригодностью для анализа различных ЛС), большой производительностью и возможностью автоматизации процесса анализа.

Избранный для этой цели метод должен быть настолько чувствительным, чтобы он позволял достоверно и точно определять в 10 раз меньшее количество, чем среднее количество вещества, всасывающееся после приема однократной дозы. Кроме того, метод должен быть достаточно специфичным, чтобы определять не изменившуюся часть лекарственного вещества в присутствии его метаболитов и эндогенных соединений.

Перечисленным требованиям отвечают в основном физикохимические методы. Химические методы анализа, рекомендованные Государственной Фармакопеей для количественного определения ЛС в лекарственных формах, такие как гравиметрические и титриметрические, из-за низкой чувствительности для этой цели непригодны.

Сравнительно редко используют фотоколориметрию. Этот метод применяют, когда нужно определить большие концентрации вещества или

628

сумму веществ. Недостаток использования фотоколориметрических методик заключается в сравнительно невысокой их точности.

Простотой выполнения и достаточной точностью отличается метод спектрофотометрии в УФ- и видимой областях спектра. Сравнительно невысокая чувствительность спектрофотометрических методик (от 1 мкг/мл до 1 мг/мл) ограничивает применение данного метода для тех групп ЛС, суточная доза которых составляет около 1 г.

По сравнению с УФ-спектрофотометрией чувствительность флуориметрического анализа значительно выше (около 0,01 мкг/мл). Особенно высокой чувствительностью отличаются спектрофлуориметрические определения. Недостатком метода является необходимость тщательной очистки испытуемых веществ, так как флуоресцировать могут многие вещества содержащиеся в биологических жидкостях.

Перечисленные методы отличаются большей эффективностью, если их применяют в сочетании с хроматографическими методами.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) обладает высокой разрешающей способностью, чувствительностью, а также отличается простотой выполнения. Метод позволяет обнаруживать до 0,025 мг лекарственного вещества. Сочетание с денситометрией позволяет увеличить чувствительность до 10-7, а при использовании специальных пластинок для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) чувствительность достигает 10-9.

Газо-жидкостная хроматография (ГЖХ) позволяет определять мик-

рограммовые и нанограммовые количества ЛС. Относительная погрешность метода + (8-15)% при содержании 10-25 нг/мл лекарственного вещества в биологической пробе. Метод ГЖХ обладает высокой разрешающей способностью, скоростью, точностью, эффективностью, наличием как специфических, так и универсальных детекторов.

Однако, способность большинства ЛС поглощать в УФ-диапазоне, термолабильность некоторых из них или необходимость получения более летучих производных – все это делает более пригодным для фармакокине-

тических исследований метод высокоэффективной жидкостной хромато-

графии (ВЭЖХ). Чувствительность ВЭЖХ определяется используемым прибором (оборудованием, детектором), а также свойствами анализируемого объекта и может достигать 10-9. Благодаря большому количеству различных колонок метод обладает высокой селективностью и разделительной способностью. Это обусловило широкое внедрение метода в практику определения ЛС в биологических жидкостях.

Одним из современных методов анализа является хромато-масс- спектрометрия, в котором масс-спектрометр используется как высокочувствительный детектор к газовому хроматографу (ГХ/МС – метод). Основ-

629

ное достоинство – чрезвычайно высокая чувствительнось, достигающая нескольких пикограммов (10-12).

Внастоящее время активно развивается новый эффективный метод количественного определения – капиллярный электрофорез (КЭФ). КЭФ объединяет различные электрофоретические и хроматографические процессы в единый метод разделения, позволяющий за несколько минут про-

вести воспроизводимые разделения с высоким разрешением при чувствительности до атоммольного уровня (10-18). Объем вводимой пробы составляет 5-50 нл. КЭФ прост в обслуживании и легко управляется, достигается быстрое разделение на сравнительно коротких колонках. Важным фактором является поддержание постоянства температуры в системе разделения, так как малейшее ее колебание приводит к резкому изменению времени удерживания веществ вследствие изменения вязкости буфера, рН, сопротивления в капилляре.

Для анализа малых концентраций ЛС и их метаболитов в биологических жидкостях широко применяются иммунохимические методы, которые отличаются высокой чувствительностью, специфичностью, простотой исполнения, позволяют одновременно анализировать большое число проб, не требуют дополнительной или специальной очистки пробы или концентрирования и поэтому очень удобны. В основе этих методов лежит специфическая реакция антител с молекулами определяемого вещества (гаптеном).

Сцелью детектирования результатов реакции один из компонентов реакции метят специальной меткой. В зависимости от природы применяемой метки и способа ее детектирования существует несколько видов иммунохимического анализа (радиоимунный анализ, иммуноферментный анализ, поляризационный флюороиммуноанализ, люминесцентный иммуноанализ и другие).

Из перечисленных методов широкое распространение в анализе ЛС в биологических жидкостях получили иммуноферментный анализ (ИФА) и поляризационный флюороиммуноанализ (ПФИА). Преимуществом данных методов является быстрота и простота проведения анализа, а также отсутствие стадии выделения ЛС из биологической жидкости. Недостатком метода является обязательное наличие наборов реагентов к конкретному прибору на каждое анализируемое вещество, при этом перечень данных наборов достаточно ограничен, что не позволяет определять любое желаемое ЛС.

Вцелом любой метод количественного определения обладает рядом преимуществ и недостатков, которые и определяют показания к их применению (таблица 1). Поэтому выбор должен определяться целями и задачами исследования.

630

Таблица 1. Преимущества и недостатки различных методов фар-

макокинетики

631

С учетом всех плюсов и минусов наибольшее распространение для определения ЛС в биологических жидкостях и изучения их фармакокинетики ЛС получил метод ВЭЖХ.

Материально-техническое обеспечение метода ВЭЖХ

Основными узлами высокоэффективного жидкостного хроматографа являются: насос высокого давления (может быть несколько для создания градиента), устройство для ввода проб (инжектор или автосамплер), колонка, детектор, регистрирующее устройство. Современные жидкостные хроматографы могут быть снабжены интерфейсом с компьютерной программой, с помощью которых можно автоматически производить ввод пробы, поддерживать условия хроматографического процесса по заданной программе, автоматически изменять условия анализа, проводить расчет количественного состава анализируемого ЛС и статистические расчеты.

Вкачестве детекторов в жидкостной хроматографии чаще используют спектрофотометрический детектор с переменной длиной волны или флуориметрический. Могут быть использованы и другие детекторы, например, ионизационно-пламенный, электрохимические, масс-спектрометрический.

Вобращеннофазной хроматографии обычно применяют готовые стальные колонки, заполненные силикагелем с привитыми гидрофобными

группами (“Lichrosorb C18” размером 250х4,6 мм, “Nucleosil 120-3 C18”

размером 125х4 мм, “Zorbax ODS” размером 150х4,6 мм и многие другие),

ив качестве элюента (подвижной фазы) – водные растворы, содержащие низшие спирты или ацетонитрил.

Время выхода компонента из колонки при одних и тех же условиях разделения будет всегда постоянно и может служить характеристикой данного компонента (качественный анализ), а площадь (или высота) пика – пропорциональна количеству данного компонента в пробе (количественный анализ).

На практике широко применяются жидкостные хроматографы раз-

личных фирм Shimadzu, Hewlett Packard, Gilson, Waters, Varian и другие.

Кроме того для анализа необходимы: автоматические пипетки; пробирки с завинчивающимися крышками, на 10, 15, 20 мл; конические колбы для упаривания; микрошприц на 25, 100 мкл; фильтры Мilliporе; весы (предел

взвешивания 0,01 мг/ 41 г); встряхиватель для пробирок − vortex; роторный испаритель с вакуумным насосом и водяной баней; центрифуга. В зависимости от методики вспомогательное оборудование может варьировать.

Для проведения калибровки прибора с целью построения калибровочного графика необходимы стандартные образцы определяемого ЛС и внутреннего стандарта (если он используется) с точно известным количе-

632

ственным содержанием. В анализе также используются ЛС реактивы и растворы, указанные в Государственной Фармакопее Х и ХI изданий.

Технология проведения анализа методом ВЭЖХ

Для наглядной демонстрации анализа ЛС методом ВЭЖХ в различных биологических жидкостях ниже представлены примеры определения некоторых ЛС с различными типами детекторов, условиями экстракции и хроматографирования.

Для детектирования налтрексона и ламивудина использован УФспектрофотометрический детектор, а выделение их из плазмы крови проводят методом твердо-фазной экстракции.

Детектирование нифедипина и индометацина также проводят с УФспектрофотометрическим детектором, а выделение из плазмы методом жидко-фазной экстракции. При этом из-за чувствительности производных 1,4-дигидропиридина к свету весь анализ проводят в темноте.

Использование флюориметрического детектора показано на примере анализа ацикловира и верапамила.

Иногда для повышения предела определения используют различные приемы, одним из которых является дериватизация. Анализ с дериватизацией представлен на примере определения метаболита лидокаина - MEGX. Данная методика используется при проведении MEGX - теста используемого в гепатологии для оценки функции печени. Для лучшего разделения компонентов в данной методике также используется проведение анализа не при комнатной температуре, а при нагревании колонки в термостате.

На примере налтрексона подробно описана вся процедура анализа. Остальные примеры включают в себя условия проведения определения. Данные примеры показывают, что выбор условий хроматографического анализа ЛС и их выделения из биологических жидкостей полностью определяется физико-химическими и химическими свойствами определяемого соединения.

Меняя состав подвижной фазы, тип детектора, сорбента в колонке можно подобрать такие условия, которые будут максимально соответствовать задачам анализа, позволяя проводить качественный и количественный анализ одного или нескольких компонентов в их минимальном количестве.

Определение налтрксона и его метаболита(6-β -налтрексола)

После приема налтрексона, в организме, под действием системы изоферментов цитохрома Р-450 образуется активный метаболит 6-β - налтрексол:

633

Rr = t2 t1

α = t2 − tα t1 − tα

где:

N – число теоретических тарелок (эффективность колонки);

t − время выхода пика анализируемого вещества, минуты или мм; tα − время выхода несорбируемого компонента;

t1 – время выхода первого пика; t2 – время выхода второго пика; k’ – коэффициент емкости;

W – ширина пика;

Wh/2 – ширина пика на полувысоте; R и Rr – разделение двух пиков;

α − селективность.

Расчет по Wh/2 применяется в случае использования электронного интегратора.

Предел детектирования (минимальное количество обнаруживаемое на хроматограмме) составляет 5 нг/мл, предел определения (количество вещества, площадь пика которого в пять раз превышает уровень “шумов” − базовой линии) − 7 нг/мл. Эффективность экстракции (по отношению площади пика определяемого вещества в плазме крови к площади пика данного вещества в стандартном растворе) − 89 %.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки по площади пика. С этой целью строят график зависимости площади пика вещества от его содержания в пробе в диапазоне концентраций содержащихся в плазме крови и рассчитывают параметры линейной регрессии (рисунок 2).

635

ной фазы и аликвоту 100 мкл вводят в хроматограф.

CH3 O

Индометацин

Хроматографический анализ. Анализ проводят на жидкостном хроматографе с УФ-спектрофотометрическим детектором при λ 260 нм. Используют хроматографическую колонку Диасорб 130-С16 7мкм; 4*150 мм. Элюирование проводят подвижной фазой состава ацетонитрил – вода в соотношении 66-34, доведенной 1М о-фосфорной кислотой до рН 3,0. Подвижную фазу перед использованием дегазируют под вакуумом. Скорость элюирования составляет 1,3 мл/мин. Время выхода пика индометацина 13 минут.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

Определение нифедипина

нифедипин

Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.

Экстракция. К 1 мл плазмы добавляют 200 мкл 1N раствора гидроксида натрия и 4 мл смеси хлороформ-гексан (3:7). Смесь экстрагируют в завинчивающихся пробирках 10 минут. Затем водный и органический слои разделяют центрифугированием (10 минут при 3000 об/мин). Пробы замораживают в течение 20 минут при –200С, затем органическую фазу количественно переносят в конические колбы и упаривают досуха под вакуумом с помощью роторного испарителя при температуре 370С. Сухой остаток растворяют в 120 мкл подвижной фазы. Аликвоту (100 мкл) вводят в хроматограф.

637

Хроматографический анализ. Анализ проводят на жидкостном хроматографе с УФ-спектрофотометрическим детектором при λ 238 нм. Используют хроматографическую колонку Диасорб 130-С16 7мкм; 4*150 мм. Элюирование проводят подвижной фазой состава ацетонитрил – 0,15 М раствора NaH2PO4 в соотношении 45-55. Подвижную фазу перед использованием дегазируют под вакуумом. Скорость элюирования составляет 1 мл/мин. Время выхода пика нифедипина 5,2 минуты.

Количественное определение проводят методом внутреннего стандарта (внутренний стандарт - нитрендипин или нисолдипин, время выхода − около 10 минут).

Примечание. Нифедипин и его аналоги очень быстро разлагаются на свету, поэтому все процедуры по отбору проб и их анализу следует проводить в затемненном помещении, а пробирки оборачивать темной бумагой.

Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.

Экстракция. К 1 мл плазмы крови добавляют 300 мкл 30 % HClO4, встряхивают на vortex 10 секунд, центрифугируют 10 минут при 5000 об/мин, супернатант фильтруют и аликвоту (50 мкл) вводят в хроматограф.

Хроматографический анализ. Анализ проводят на жидкостном хроматографе с флюориметрическим детектором при λ ех 260 нм и λ ем 375 нм. Используют хроматографическую колонку: Supelco LC-18-DB 5 мкм, 150*4,6 мм. Элюирование проводят подвижной фазой состава ацетонитрил – 0,02 М фосфатный буфер с рН 3,0 в соотношении 4-96. Подвижную фазу перед использованием дегазируют под вакуумом. Скорость элюирования составляет 1 мл/мин. Время выхода пика ацикловира 4,1 минуты.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

Определение верапамила и его активного метаболита

После приема верапамила, в организме, под действием системы изоферментов цитохрома Р-450 образуется активный метаболит норверапамил:

638

Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.

Экстракция. К 1 мл плазмы добавляют 100 мкл 2М NaOH и 5 мл гептана. После экстрагирования в течение 10 минут пробы центрифугируют 15 минут при 3000 об/мин, затем органический слой количественно переносят в чистые пробирки, добавляют 130 мкл 10% H2SO4, встряхивают на vortex в течение 1 минуты, центрифугируют 4 минуты при 3000 об/мин и аликвоту (100 мкл) вводят в хроматограф.

Хроматографический анализ. Анализ проводят на жидкостном хроматографе с флюориметрическим детектором при λ ех 203 нм и λ ем без фильтра. Используют хроматографическую колонку Zorbax ODS 4,6*150 мм. Элюирование проводят подвижной фазой состава ацетонитрил – фосфатный буфер с рН 3,7 в соотношении 29 - 71. Подвижную фазу перед использованием дегазируют под вакуумом. Скорость элюирования составляет 1,2 мл/мин. Время выхода пика верапамила 15 минут, норверапамила 14 минут.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

Определение лидокаина и его метаболита

(метаболит лидокаина)

После введения лидокаина, в организме в гепатоцитах, под действием системы изоферментов цитохрома Р-450 образуется метаболит MEGX.

Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.

639

Экстракция. К 500 мкл плазмы (или сыворотки) добавляют 250 мкл раствора внутреннего стандарта в ацетонитриле (0,2 мг/л) и 15 секунд перемешивают на vortex, затем добавляют 500 мкл боратного буфера (рН 9,5)

и15 секунд перемешивают на vortex, далее добавляют 2 мл дихлорметана

ивстряхивают на vortex 1 минуту. Пробы центрифугируют 10 минут при

4000 об/мин. Органический слой переносят в коническую колбу и упаривают его на роторном испарителе под вакуумом при 370С.

Дериватизация. Выпаренный экстракт растворяют в 100 мкл насыщенного раствора тетрабората натрия в метаноле, добавляют 10 мкл све-

жеприготовленного раствора NBD-F (10 мг/мл в смеси этанол - ацетонитрил 3:1), встряхивают на vortex 5 секунд и нагревают при 600С 10 минут. Затем пробу охлаждают, добавляют 10 мкл 25% HCl и встряхивают на vortex 5 секунд. Аликвоту (50 мкл) вводят в хроматограф. Дериватизация с MEGX c NBD-F проходит по следующей схеме:

Хроматографический анализ. Анализ проводят на жидкостном хроматографе с флюориметрическим детектором при λ ех 340 нм и λ еm 520 нм. Используют хроматографическую колонку Ultrasphere ODS 5 мкм; 4,6*250 мм. Элюирование проводят подвижной фазой состава ацетонитрил – 0,05 М фосфатный буфер с рН 5,0 - тетрагидрофуран в соотношении 37-59-7. Подвижную фазу перед использованием дегазируют под вакуумом. Скорость элюирования составляет 1,5 мл/мин. Разделение проводят при температуре колонки 470С. Время выхода пика MEGX 8,2 минуты, внутреннего стандарта 12,3 минуты.

Количественное определение проводят методом внутреннего стандарта. Внутренний стандарт – MРGX:

640

Примечание. Данная методика требует четкого выполнения всех постадийных условий, иначе дериватизация будет протекать не количественно.

Рисунок 1. Хроматограмма стандартного раствора налтрексона и его метаболита (а), «чистой» плазма (б) и плазмы, содержащей налтрексон и его метаболит (в).

641