Работа 105. Определение ацетилирующей способности организма по выделению с мочой свободной и ацетилированной форм сульфаниламидов по а.М.Тимофеевой в модификации г.А.Пономарева

Процесс ацетилирования является одной из разновидностей реакций конъюгации ксенобиотиков, происходящих в клетках с участием ферментов. Ариламины, в том числе сульфаниламиды, подвергаются N-ацетилированию в организме и поэтому по выделению свободной и ацетилированной форм этих веществ можно оценить активность процесса ацетилирования.

Реактивы. Соляная кислота, 10%-ный раствор; нитрит натрия, 0,5%-ный раствор, свежеприготовленный; ацетат натрия, насыщенный раствор; Н-кислота ацетилированная, свежеприготовленный 0,5%-ный раствор.

Оборудование. Водяная баня; штатив с пробирками; пробки, обернутые фольгой; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; ФЭК.

Материал. Моча, содержащая свободный и ацетилированный сульфаниламиды. (Для получения мочи белым крысам вводят внутрижелудочно с помощью зонда порошок сульфадимезина из расчета 0,5 г на 1 кг массы тела в виде взвеси в 3 мл воды. Животных отсаживают на сутки в стеклянные выделительные воронки для сбора мочи. Собранную мочу доводят дистиллированной водой до объема 25 мл и фильтруют через бумажный фильтр).

Метод основан на способности диазотированного сульфаниламида при взаимодействии с ацетилированной Н-кислотой (1,6-аминооксинафталин-3,5-дисульфокислота) образовывать комплекс розового цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации сульфаниламида.

Содержание суммы сульфаниламидов (ацетилированных и свободных) в моче устанавливают после гидролиза проб с соляной кислотой, в ходе которого происходит образование свободной формы сульфаниламида из ацетилированной.

Ход определения. В две пробирки (одна для определения общего, а другая – свободного сульфадимезина) отмеривают по 1 мл разведенной в 20 раз мочи, по 1,5 мл дистиллированной воды и по 0,25 мл раствора соляной кислоты. В третью пробирку (контрольная) вносят 2,5 мл воды и 0,25 мл раствора соляной кислоты.

Одну пробирку (для определения общего сульфадимезина) закрывают пробкой, обернутой фольгой, и ставят на гидролиз в кипящую водяную баню на 15 мин. Затем пробирку охлаждают.

Во все три пробирки приливают по 2 капли раствора нитрита натрия, тщательно перемешивают содержимое и оставляют стоять 10 мин. Добавляют во все пробы по 1,5 мл насыщенного раствора ацетата натрия, закрывают пробирки пробками и энергично встряхивают их несколько раз.

Прибавляют во все пробирки по 0,25 мл раствора ацетилированной Н-кислоты. Вновь перемешивают содержимое и оставляют стоять пробы на 15 мин для развития окрашивания.

Измеряют экстинкцию опытных проб против контроля на ФЭКе при 440 нм (светофильтр синий) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет проводят по формуле

(Е₂ – Е₁)100

х = ——————— ,

Е₂

где х – ацетилирующая способность организма, % ацетилированного сульфадимезина

Е₁ – экстинкция свободного сульфадимезина, содержащегося в пробе, не подвергшейся гидролизу;

Е₂ – экстинкция общего сульфадимезина (свободный + ацетилированный), содержащегося в пробе, подвергнутой гидролизу.

Оформление работы. Занести значения экстинкции в тетрадь и рассчитать ацетилирующую способность организма по сульфадимезину. Сделать вывод о возможности метаболизма ксенобиотиков посредством ацетилирования и значении этого процесса.

Практическое значение работы. По степени ацетилирования сульфаниламидов или других ксенобиотиков, подвергающихся в организме ацетилированию, судят об активности ферментной системы ариламинацетилтрансферазы в клетках, которая катализирует реакции ацетилирования (конъюгации) различных соединений. Для сульфаниламидов реакция ацетилирования является основным ведущим механизмом конъюгации, другие конъюгаты для большинства сульфаниламидов образуются в незначительном количестве. Ацетилирование приводит к инактивации (обезвреживанию) сульфаниламидов и выведению их из организма с мочой. Поэтому степень ацетилирования сульфаниламидов указывает также на соотношение бактериостатически активной и неактивной форм препаратов. Чем быстрее ацетилируется сульфаниламид, тем меньше его бактериостатическая активность