Работа 67. Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии

Фенилкетонурия, или фенилпировиноградная олигофрения, связана с дефектом фермента фенилаланингидроксилазы, вследствие чего нарушается превращение фенилаланина в тирозин. При этом увеличивается содержание фенилаланина и продуктов его обмена (в частности, фенилпировиноградной кислоты) в крови и моче.

Реактивы. Фенилаланин, стандартный раствор 0,06 г/л; растворитель (бутанол, уксусная кислота и вода в соотношении 15:15:10); нингидрин, 0,5%-ный раствор в ацетоне; хлорид железа (III), 10%-ный раствор; набор «Биофан П» (ГДР), содержащий индикаторную бумагу с цветной шкалой.

Оборудование. Хроматографическая бумага 11х11; микропипетки; чашка Петри; ножницы; сушильный шкаф, отрегулированный на 90-100˚С; фильтровальная бумага; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; глазные пипетки.

Материал.

1. Моча, нормальная и патологическая, содержащая фенилпировиноградную кислоту.

2. Плазма крови здорового и больного человека с повышенным содержанием фенилаланина.

а. Экспресс-определение фенилаланина в плазме крови методом бумажной радиальной хроматографии. Метод основан на различной скорости передвижения фенилаланина по хроматографической бумаге вследствие разности коэффициентов распределения его между неподвижной и подвижной фазами растворителя. Положение аминокислот на хроматограмме, которая представлена в виде концентрических кругов, выявляется нингидриновой реакцией.

Ход определения. Складывают квадрат хроматографической бумаги вчетверо и делают вырез в центре его диаметром около 1 см.

Квадрат хроматографической бумаги простым карандашом делят на секторы, нумеруют их от 1 до 4, отступив от центра выреза на 1 см, и намечают карандашом в каждом секторе кружки для нанесения проб. Помещают квадрат на ножку, сделанную из фильтровальной бумаги в виде трубочки высотой 2 см и вставленную в центральный вырез.

Наносят микропипеткой в обведенный кружок 1-го сектора 0,02 мл стандартного раствора фенилаланина, затем подсушивают пятно с помощью вентилятора и на высушенное место наносят 0,02 мл плазмы крови здорового человека; в кружок 2-го сектора наносят 0,02 мл плазмы здорового человека и 3–й сектор – 0,02 мл плазмы обследуемого больного пациента. Оставляют бумагу на воздухе до полного высыхания нанесенных проб.

В чашку Петри наливают растворитель, кладут бумажный квадрат на края чашки Петри, при этом конец ножки погружается в растворитель. Закрывают чашку крышкой и оставляют при комнатной температуре, пока фронт растворителя не достигает диаметра около 5 см (отметку карандашом сделать заранее). После этого хроматограмму высушивают в сушильном шкафу при 90-100˚С, опрыскивают ее раствором нингидрина и вновь помещают в сушильный шкаф на 10 мин.

В отрицательных пробах (содержание фенилаланина ниже 0,07 г/л) окрашивается пятно нанесенной плазмы и небольшая окружающая часть. Пятно со стандартным раствором фенилаланина (0,06 г/л) и плазмой здорового человека (0,01 г/л) содержит в сумме 0,07 г/л фенилаланина. Исследуемые образцы, дающие такой же или больший ореол, считают положительными. В пробах, взятых у больных фенилкетонурией, обнаруживается четкий ореол диаметром около 3,5 см.

Оформление работы. Зарисовать полученную хроматограмму, сравнить величину окрашенных зон в трех секторах и сделать вывод относительно изменений у больного пациента.

б. Обнаружение фенилпировиноградной кислоты в моче. Метод основан на взаимодействии енольной формы фенилпировиноградной кислоты с хлоридом железа FeCl₃ с образованием комплексного соединения сине-зеленого цвета.

Ход определения. В одну пробирку наливают 0,5 мл мочи здорового, а в другую – больного человека, добавляют по 5 капель раствора хлорида железа (III) и наблюдают за появлением окрашивания.

Эту реакцию дают различные вещества, хотя окраска их соединений с хлоридом железа FeCl₃ неодинакова. При наличии в моче достаточных количеств фенилпировиноградной кислоты развивается сине-зеленое или темно-зеленое окрашивание, исчезающее через 5-10 мин. Сходное окрашивание может давать билирубин мочи.

в. Обнаружение фенилпировиноградной кислоты в моче с помощью набора «Биофан П».

Ход определения. Индикаторную бумажку смочить мочой и через 30 с сравнить окраску индикатора с цветной шкалой.

Оформление работы. Сравнить характер окрашивания в нормальной и патологической моче, сделать вывод о предполагаемой молекулярной болезни и указать причины.

Практическое значение работы. В норме содержание фенилаланина в плазме крови составляет у детей до 1 месяца 75-100 мкмоль/л (0,025-0,05 г/л) и от 2 месяцев до 14 лет 25-75 мкмоль/л. С мочой его экскретируется у детей до года 6,0-24,0 и от года до 14 лет 6,0-72,0 мкмоль/сут. Применяемые пробы на присутствие фенилпировиноградной кислоты в моче здорового ребенка отрицательны.

При фенилкетонурии содержание фенилаланина в крови повышается до 600-2400 мкмоль/л, а выделение с мочой составляет до 3,0-12,0 мкмоль/сут. Пробы на фенилпировиноградную кислоту в моче становятся положительными. Причем содержание ее в суточной моче составляет 0,05-3,0 г или 0,3-18 ммоль.

При поражениях печени (вирусный гепатит, отравление гепатотропными ядами) нарушается гидроксилирование фенилаланина, который вследствие трансаминирования превращается в фенилпировиноградную кислоту. Поэтому у таких больных увеличивается содержание фенилаланина в сыворотке крови и выделение фенилпировиноградной кислоты с мочой соответственно тяжести течения заболевания.