35. Экспрессия белков с использованием векторов с регулируемыми элементами фага лямбда

Ответ. Одним из способов повышения выхода целевого продукта является увеличение в клетке количества копий целевого гена. Для амплификации генов в клетках Eschericha coli используют векторы на основе мультикопийных плазмид, нитчатых фагов (например, М13) и бактериофага лямбда. Известны примеры эффективной экспрессии нескольких копий целевого гена в составе вектора, обеспечивающие повышение выхода рекомбинантного белка. Так, при клонировании двух, трех и четырех копий гена альфа-8 интерферона в составе рекомбинантной плазмиды имело место пропорциональное увеличение синтеза интерферона по сравнению с плазмидой, несущей одну копию этого гена. Хотя имеются примеры успешного использования для суперсинтеза целевых белков фагов лямбда, полученных как in vivo, так и in vitro, тем не менее, векторы на основе фага лямбда очень широко применяют для клонирования целевого гена, а для достижения высокоэффективной экспрессии, как правило, гены встраивают в плазмидные векторы под контроль сильных и регулируемых промоторов. Прежде всего это обусловлено тем, что при выполнении генно-инженерных работ манипулировать плазмидной ДНК более удобно, чем фаговой. Однако использование бактериофагов для биосинтеза рекомбинантных белков имеет определенные преимущества. Как известно, выход целевых продуктов во многом зависит от стабильности рекомбинантных молекул в процессе хранения и культивирования клеток продуцента. Но исследователи часто сталкиваются с проблемой сегрегационной нестабильности рекомбинантных плазмид. Она приводит к уменьшению числа репликонов, что увеличивает образование в процессе деления бесплазмидных клеток и соответственно уменьшению конечного выхода целевого продукта. В то же время рекомбинантные молекулы, сконструированные на основе бактериофага лямбда, не утратившего способности к интеграции в бактериальную хромосому и дальнейшему исключению из нее, характеризуются стабильностью в лизогенном состоянии (интегрированном в бактериальную хромосому) и способностью к 100–200-кратной амплификации клонируемых генов при литическом развитии фага. Еще одним преимуществом использования фаговых векторов в биотехнологическом процессе является то, что литическое развитие фага заканчивается лизисом бактериальной клетки и в результате этого рекомбинантный белок самопроизвольно высвобождается из клеток в культуральную среду. А это позволяет избежать технологических сложностей, связанных с извлечением целевого продукта из бактериальных клеток, особенно в условиях крупномасштабного производства. Амплификация генов в составе фага А достигается индукцией лизогенных или инфекцией реципиентных клеток. Выражение привнесенных генов может контролироваться как собственным промотором, так и одним из фаговых. Во время вирусной инфекции размножающиеся вирусы овладевают контролем над экспрессией генов клетки-хозяина и используют ее для своих собственных нужд, что является общим свойством всех внутриклеточных паразитов и симбионтов. Многие из бактериофагов осуществляют контроль транскрипции на уровне элонгации. Механизмы контроля транскрипции на уровне элонгации РНК у бактериофага λ изучены лучше, чем у других вирусов. Ключевые регуляторные фаговые белки N и Q контролируют транскрипцию всего фагового генома, обеспечивая антитерминацию транскрипции в местах обычного прекращения синтеза вирусных РНК, т.е. на терминаторах транскрипции. В результате происходит транскрипция всех генов, необходимых для размножения бактериофага, и он вступает на вирулентный путь развития, приводящий к лизису бактериальных клеток и выходу зрелых фаговых частиц в окружающую среду. Механизм антитерминации, обеспечиваемой N-белком, отличается от механизма Q-зависимой антитерминации. N-Белок осуществляет свои функции при прохождении элонгирующей РНК-полимеразой особых последовательностей ДНК (бокс А и бокс В), обеспечивающих сборку комплекса элонгирующей РНК-полимеразы и N-белка. Белок N сам по себе является РНКсвязывающим белком, и его взаимодействие с РНК стабилизируется Nus белками E. coli. Его объединение с РНК и комплексом сопутствующих белков заставляет элонгирующую РНК-полимеразу не замечать сигналы терминации на ДНК, как зависимые, так и не зависимые от факторов терминации транскрипции. Во время антитерминации транскрипции, опосредуемой Q-белком, последний взаимодействует с нетранскрибируемой цепью ДНК промоторного или элонгирующего комплексов в пределах первых 20–25 нуклеотидов ниже точки инициации транскрипции позднего фагового промотора. При этом белок Q не образует комплекса с РНК и оказывает свое действие на транскрипцию через регуляторную субъединицу РНК-полимеразы ζ70. Для реализации Qзависимой антитерминации in vivo необходимо, чтобы произошла задержка в перемещении элонгирующей РНК-полимеразы вдоль матрицы вскоре после инициации транскрипции. В это время уже освободившаяся из транскрипционного комплекса ζ-субъединица входит в контакт с нетранскрибируемой цепью ДНК в открытом участке, расположенном на 15 нуклеотидов ниже точки инициации транскрипции. Таким образом, ζ-субъединица остается ассоциированной с транскрибирующим комплексом и опосредует антитерминирующее действие Q белка на больших расстояниях от промотора. В этом случае совместное действие фактора инициации транскрипции (ζ-субъединицы) и ДНК-связывающего белкаантитерминатора изменяют свойства элонгирующей РНК-полимеразы, которая освобождает промотор после кратковременной паузы в элонгации. Эти свойства ζ-субъединицы, проявляемые во время вирусной инфекции, позволяют предположить о ее возможном участии в контроле транскрипции бактериальных генов на уровне освобождения промотора и элонгации синтеза РНК.