- •Генная инженерия теория
- •1. Основные открытия современной биологии, послужившие фундаментом для возникновения генетической инженерии
- •2. Предмет и задачи генной инженерии и ее связь с другими биологическими дисциплинами
- •3. Рестрикцирующие эндонуклеазы I, II и III класса
- •4. Особенности ферментов рестрикции II класса
- •5. Другие ферменты нуклеазного действия (s1-нуклеаза, Bal31-нуклеаза, нуклеаза из микрококка, днк-аза)
- •10. Векторы на основе репликонов бактериальных плазмид (pBr322, puc18)
- •11. Векторы на основе бактериофагов (м13, λ)
- •12. Векторы на основе вирусов животных
- •13. Векторы на основе Тi-плазмид
- •14. Основные подходы к получению библиотек днк прокариотических и эукариотических организмов
- •15. Скрининг рекомбинантных днк библиотек
- •16. Получение библиотеки днк с помощью вирусных или плазмидных векторов
- •17. Получение библиотеки днк из отобранных популяций молекул мРнк
- •18. Выявление нужных клонов в генной библиотеке путем гибридизации с радиоактивным днк-зондом
- •19. Выделение перекрывающихся клонов днк («прогулка по хромомсоме») с целью идентификации соседних генов
- •20. Выделение и очистка рекомбинантных клонов
- •21. Секвенирование днк
- •22. Полимеразная цепная реакция (пцр)
- •23. Виды пцр
- •24. Мутагенез клонированной днк
- •25. Методы секвенирования днк
- •26. Использование нерадиоактивных меток при секвенировании. Конструирование делеций для секвенирования.
- •27. Приготовление матриц для секвенирования днк
- •28. Использование для анализа баз данных днк и белковых последовательностей (GenBank, embl, fasta, pir и т.П.)
- •29. Амплификация днк с помощью пцр
- •30. Амплификация рнк с помощью пцр
- •31. Сайт-специфический мутагенез
- •32. Направленный мутагенез с помощью олигонуклеотидов
- •33. Мутагенез с использованием пцр
- •34. Экспрессия белков в e.Coli
- •35. Экспрессия белков с использованием векторов с регулируемыми элементами фага лямбда
- •36. Экспрессия белков с использованием специальных экспрессирующих векторов
- •37. Повышение эффективности систем экспрессии эукариотических белков в клетках e.Coli
- •38. Генно-инженерные системы для получения бав
- •39. Анализ белков
- •40. Генно-инженерная система бактерий рода Bacillus
- •41. Генно-инженерные системы грам-положительных микроорганизмов родов Streptomyces
- •42. Генно-инженерные системы коринеформных бактерий
- •43. Генно-инженерная система дрожжей Saccharomyces
- •44. Системы экспрессии на основе бакуловирусов
- •45. Продукция больших количеств белков в клетках насекомых
- •46. Системы для экспрессии белков в животных клетках
- •47. Векторы экспрессии на основе вирусов животных
- •48. Электрофоретический анализ белков
- •49. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот
- •50. Иммуноблоттинг и иммунодетекция
- •51. Введение днк в клетки животных, растений, бактерий, дрожжей
- •52. Конструирование линий клеток, суперпродуцирующих бав
- •53. Получение трансгенных растений и животных с полезными свойствами
- •54. Генная тераия болезней человека и животных, являющихся следствиями дефектов генетического аппарата и его функций
30. Амплификация рнк с помощью пцр
Ответ. На первом этапе с помощью обратной транскриптазы (ОТ) получают ДНК – копию целевой РНК, а затем осуществляют ПЦР. Такая система называется ОТ-ПЦР. Обратные транскриптазы имеют две основные ферментативные активности: ДНК – полимеразную РНКазы Н. Последняя направлена на гидролиз комплексов РНК-ДНК и поэтому значительно снижает эффективность синтеза кДНК in vitro. Методами генетической инженерии удалось получить варианты обратной транскриптазы с существенно сниженной активностью РНКазы Н и оптимальной активностью для синтеза кДНК. Использование ревертазы связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, данный фермент термолабилен и поэтому может быть использован при температуре не выше 42°С. Так как при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, то эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Этот недостаток может быть устранен при использовании в качестве обратной транскриптазы термостабильной полимеразы, проявляющей активность в присутствии ионов Мn2+. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную, так и транскриптазную активность. Для проведения реакции обратной транскрипции в реакционной смеси так же, как и в ПЦР, в качестве затравки должны присутствовать праймеры и смесь 4-х дНТФ. Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет спектр применения этого метода, например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирусы гриппа, ВИЧ и т.д.) представлены именно РНК. Технологии рекомбинантных ДНК – это совокупность процедур, позволяющих осуществить конструирование нового генного комплекса и перенос его в организм-реципиент, где новый генетический материал начинает работать. Не существует единого универсального набора методик, все зависит от конкретной задачи, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме. Получение нужной последовательности – ДНК для клонирования может быть получена химико-ферментативным синтезом, обратной транскрипцией мРНК и путем непосредственного расщепления геномной ДНК нужной рестрикционной эндонуклеазой. Но самый распространенный путь сейчас – синтез ДНК методом ПЦР. После выбора и синтеза праймеров к известной последовательности, ДНК можно амплифицировать методом ПЦР с использованием, в том числе и вырожденных праймеров (с неполной комплементацией). В качестве матрицы для синтеза используют геномную ДНК или матричную РНК, в этом случае первым шагом в синтезе целевой последовательности будет синтез комплементарной ДНК (кДНК) обратной транскриптазой (ревертазой – РТ), затем обычная ПЦР. Иногда эти реакции объединяют в одну РТ-ПЦР (RTPCR). Как правило, в концы ПЦР-праймеров вводят сайты рестриктаз для удобства дальнейшего клонирования синтезированной последовательности. Нужную последовательность ДНК также можно получить химико-ферментативным синтезом, при этом производят сборку полноразмерного гена из отдельных синтетических олигонуклеотидов различными способами. Химический синтез гена осуществляют, как правило, когда организм-донор ДНК не доступен или когда нуклеотидная последовательность природного гена может плохо транслироваться в выбранном организме-реципиенте вследствие несовпадения частоты использования кодонов, а также по другим причинам. После обработки рестриктазами полученный ген соединяют (лигируют) с клонирующим вектором с образованием новой, рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК». Вектор для клонирования – общий термин, обозначающий молекулу ДНК, способную к включению чужеродной ДНК и к автономной репликации, служит инструментом для введения генетической информации в клетку. То есть является молекулойносителем, подобно космической ракете-носителю, для клонируемой ДНК. Полученную рекомбинантную конструкцию вводят в клетку-мишень (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией (в основном для прокариот и дрожжей) и трансфекцией (в случае эукариот). В зависимости от типа вектора и схемы эксперимента рекомбинантная ДНК может либо реплицироваться автономно, либо встроиться в хромосому клетки-хозяина. Используя селективный маркер, идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. Например, высевают трансформированные клетки на селективную среду с антибиотиком, ген устойчивости к которому несет использованный вектор – расти будут только колонии (клоны) рекомбинантных клеток. Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.