3. Рестрикцирующие эндонуклеазы I, II и III класса

Ответ. Рестриктазы (рестрицирующие эндонуклеазы, эндонуклеазы рестрикции) – это ферменты, узнающие и атакующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции). В основе классификации рестриктаз главная роль отводится потребности фермента в кофакторах и характеру расщепления ДНК. Рестриктазы класса I. Наиболее изучены ферменты ЕсоК и ЕсоВ. Они выделены из клеток Е. coli К12 и Е. coli В и при этом схожи по структуре. Оба фермента содержат три типа неидентичных субъединиц с молекулярной массой 135,60 и 50 кДа, но отличаются по соотношению субъединиц. Свойства рестриктаз класса I: требуют в качестве кофакторов аденозинтрифосфат (АТР), Sаденозинмонофосфат (SAM), ионы Mg2+; расщепление ДНК совмещено с гидролизом АТР; в едином субъединичном белке имеются следующие ферментативные активности: расщепление ДНК (α-субъединица); метилирование ДНК (β-субъединица) и узнавание специфической последовательности ДНК (γ-субъединица). Ферменты ЕсоВ и ЕсоК узнают строго специфичные последовательности. При этом разрыв ДНК происходит случайным образом на значительном расстоянии от участка узнавания – 400–7000 пн. Продукты расщепления ДНК гетерогенны. Особенности. Общую модель действия рестриктаз на ДНК предложили в 1988 г. Ф. Студиэр и П. Бэндепедхяй. Фермент после взаимодействия с ДНК в сайте рестрикции инициирует АТР-зависимую транслокацию (перемещение) цепей ДНК через себя в обоих направлениях. При встрече двух соседних молекул фермента, транслоцирующих ДНК, они разрезают двухцепочечную ДНК в районе контакта. Причина гетерогенности продуктов гидролиза ДНК рестриктазами класса I – неодновременное случайное взаимодействие молекул фермента с разными участками узнавания на каждой молекуле ДНК и, соответственно, неодновременное начало транслокации цепей ДНК. Рестриктазы класса II. Системы рестрикции-модификации класса II представлены отдельными белками рестрикционной эндонуклеазы и модификационной метилазы. Поэтому эти рестриктазы можно выделить в индивидуальном состоянии, свободном от метилазной активности, что в значительной мере упрощает их изучение и последующее использование для расщепления молекул ДНК. Рестриктазы класса II состоят из белков с относительно простой организацией – представлены двумя субъединицами одного типа с небольшой молекулярной массой. Особенности: узнают и разрезают немодифицированную двухцепочечную молекулу ДНК по специфичным нуклеотидным последовательностям. В результате образуется дискретный набор фрагментов анализируемой ДНК; для специфического действия требуются лишь ионы Mg2+ в физиологических концентрациях; как правило, узнают последовательности длиной 4–8 пн, имеющие ось второго порядка, – палиндромы. Некоторые рестриктазы, например, AluI расщепляют ДНК строго по оси симметрии узнаваемой последовательности, что приводит к образованию фрагментов ДНК с тупыми концами. Фермент EcoRI узнает гексануклеотидную последовательность и разрезает ее с образованием взаимокомплементарных одноцепочечных липких концов. Если гидролизовать молекулы ДНК различного происхождения рестриктазой ЕcoRI, то в каждом случае будет образовываться строго определенный специфический набор фрагментов ДНК с идентичными липкими концами. При смешивании разных препаратов таких фрагментов ДНК в определенных условиях липкие концы могут слипаться за счет комплементарных взаимодействий, и таким образом могут стыковаться фрагменты молекул ДНК, выделенных из любых организмов. Данные свойства стали причиной частого использования рестриктаз класса II в ГИ. Кроме выступающих 5'-концов рестриктазы могут образовывать также липкие 3'-концы. Пример: рестриктаза PstI. Ряд рестриктаз узнают частично вырожденные последовательности, поэтому они лишены высокой специфичности. Например, Hindll узнает и расщепляет последовательности с общей формулой GTPy↓PuAC. Размер узнаваемой рестриктазой последовательности, как правило, обусловливает частоту встречаемости этих участков в природных ДНК. Для случайной последовательности ДНК бесконечной длины с равным содержанием каждого из четырех нуклеотидов вероятность наличия определенной последовательности длиной N (РN) на молекуле ДНК будет равна 4-N, причем вырожденность последовательности участков узнавания, обнаруженная для некоторых рестриктаз, увеличивает данную вероятность. Рестриктазы, узнающие последовательность из четырех пн, часто называют мелкощепящими, рестриктазы с участком узнавания в шесть и более пн – крупнощепящими. Если обнаруженная рестриктаза распознает новую последовательность, она называется прототипом. В настоящее время выделено более 500 рестриктаз класса 2, однако среди ферментов, выделенных из различных микроорганизмов, встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те же последовательности. Такие пары или группы называют изошизомерами. Различают истинную изошизомерию, когда ферменты узнают одну и ту же последовательность нуклеотидов и разрывают ДНК в одних и тех же точках, и ложную – гетерошизомеры, когда ферменты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят разрывы в разных точках в пределах того же сайта. Если предположить, что участки узнавания рестриктаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность (сайт) из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, – через 4096 пар оснований. Если сайт рестрикции окажется внутри гена, то обработка ДНК-рестриктазой приведет к его инактивации. Вероятность такого события очень велика при обработке мелкощепящими рестриктазами и незначительна при применении крупнощепящих эндонуклеаз. Поэтому с целью получения неповрежденного гена расщепление проводят поочередно несколькими крупнощепящими рестриктазами, либо применяют прием "недорестрикции", т.е. рестрикцию проводят в таких условиях, когда происходит расщепление лишь в одном сайте. Рестриктазы класса III. В какой-то степени схожи с рестриктазами класса I. Нативный фермент содержит две различные субъединицы. Он бифункционален проявляет как рестриктазную, так и метилазную активность. Рестриктазы класса III узнают несимметричные последовательности длиной 5-6 пн и расщепляют ДНК в стороне от участков узнавания на расстоянии 24–27 пн, образуя одноцепочечные 5'-концы длиной 2–3 нуклеотида. Для проявления эндонуклеазной активности требуются только АТР и ионы Mg2+, a SAM лишь стимулирует реакцию. Расщепление ДНК не сопровождается гидролизом АТР. Эти ферменты in vitro не обеспечивают нужного гидролиза ДНК. Причины этого пока неизвестны.