mikrobiologiia

271

некоторыми другими сахарами. Другими словами, есть «большой» и «малый» «пестрый ряд».

Под действием ферментов микроба одни углеводы остаются неизменными и, следовательно, цвет питательной среды не меняется, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикатора и, соответственно, цвет питательной среды.

Среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добавлением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими средами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают «поплавок» — трубочку диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца. «Поплавок» помещают запаянным концом кверху; при стерилизации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в «поплавке», вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек.

В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стойкой пены на ее поверхности.

Таким образом, при изучении сахаролитических ферментов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в питательной среде конечных газообразных продуктов.

Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, содержащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуемой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике.

Протеолитические свойства микроорганизмов. Протеазы катализируют расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные продукты распада — пептоны, альбумозы и полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны в свою очередь расщепляются на полипептиды (соединения двух или нескольких аминокислот) и отдельные аминокислоты.

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели применяют желатин, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коагулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса.

Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. Поэтому для разных видов микробов рекомендуют питательные среды различного состава.

Определение индола в культуре микроорганизмов. Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической аминокислоты — триптофана. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в среду Строгова или другие среды, рекомендуемые для обнаружения индола. Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную

272

раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды. Для этого верхнюю треть бумажной полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Посевы инкубируют 24—48 ч при температуре 37°С. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете.

Определение сероводорода. Сероводород является конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю исследуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном или бульоном Хоттингера. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги на определение сероводорода. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфид свинца, который придает индикаторной бумаге чернобурое окрашивание. Окончательный учет результатов на образование индола и сероводорода проводят на 7—10 й день после посева, так как процесс ферментативного расщепления белка и образования конечных продуктов распада происходит иногда в течение длительного времени.

Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов. В

культуре микробов могут быть обнаружены окислительно-восстановительные ферменты, связанные главным образом с дыхательной функцией микроорганизма.

Как известно, процесс окисления субстрата может происходить посредством присоединения к нему кислорода с участием ферментов оксидаз или в результате отщепления от него водорода с участием ферментов дегидрогеназ. Для этого типа реакции характерно то, что окисление какоголибо одного вещества всегда сопровождается восстановлением (редукцией) другого органического вещества. Первое вещество, от которого отщепляется водород, называют донатором, а то вещество, к которому он присоединяется, — акцептором.

Акцептором водорода чаще всего является кислород воздуха, однако им могут быть также многие органические соединения, способные легко окисляться и восстанавливаться.

Сцелью выявления ферментов дегидрогеназ и определения их активности

впрактике микробиологических исследований предложен метод, основанный на введении в питательную среду органической краски, выполняющей роль акцептора водорода. В результате присоединения водорода краситель восстанавливается, превращаясь в бесцветное соединение, называемое лейкобазой. При обильном доступе кислорода оно может вновь окислиться и приобрести прежний цвет.

В качестве акцептора водорода используют метиленовый синий, лакмусовую настойку, малахитовый зеленый, индигокармин, нейтральный красный и др.

Для выявления редуцирующих свойств микроорганизмов указанные красители добавляют к обычным питательным средам: МПБ, МПА, молоку.

273

Один и тот же вид микроба ведет себя неодинаково по отношению к краскам разного состава. Это свойство микроба использовано в микробиологической практике в качестве дифференциального признака. Бактерии брюшного тифа редуцируют метиленовый синий, но не редуцируют лакмуса и не изменяют нейтрального красного в противоположность кишечной палочке, которая остается нейтральной в отношении метиленового синего, но восстанавливает лакмус и нейтральный красный.

Определение редуцирующей способности.

1.В 5 мл среды (молока с метиленовым синим) засевают петлю исследуемой культуры с плотной питательной среды или 0,1 мл 18-часовой бульонной культуры и после 24 ч инкубации учитывают результаты роста. При положительной реакции на редукцию метиленового синего среда из голубой становится кремового цвета, а при слабоположительной — приобретает зеленоватое окрашивание.

2.Пробирки с лакмусовым молоком, средой Минкевича засевают так же, как молоко с метиленовым синим, суточной культурой с плотной или жидкой питательной среды. Посевы инкубируют в термостате в течение 10 дней, ежедневно наблюдая за изменением цвета среды. Редукция лакмуса проявляется полным обесцвечиванием молока, имеющего розовато-сиреневый цвет до посева. В протоколе исследования редукцию лакмуса обозначают буквой Р.

Среда Минкевича позволяет также выявлять кислотоили щелочеобразование, выражающееся соответственно в покраснении или посинении молочной среды. Образование кислоты обозначается буквой К, щелочи — буквой Щ.

Определение фермента каталазы. Некоторые виды микроорганизмов, принадлежащие к группе аэробов, в процессе дыхания образуют перекись водорода, являющуюся клеточным ядом. Количество перекиси водорода в культуре никогда не достигает высоких концентраций, так как по мере образования перекись расщепляется на воду и молекулярный кислород при участии фермента каталазы.

На поверхность микробной культуры, выращенной на плотной питательной среде в чашке Петри, наносят 1—2 мл 1% раствора перекиси водорода так, чтобы она покрывала поверхность культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в слое нанесенной жидкости свидетельствует об образовании кислорода в результате расщепления перекиси водорода под действием каталазы. Подобный результат в протоколе опыта отмечается знаком

+как положительный результат реакции на каталазу.

Определение протеолитических (гнилостных) бактерий.

Соответствующее разведение продукта засевают на молочный агар инкубацию посевов проводят при 30 0С в течение 72 часов. Протеолитические бактерии на молочном агаре при своем росте образуют зоны просветления агара (зоны протеолиза). Пептонизирующие бактерии образуют узкие зоны пептонизации.

Определение коагулазоположительных стафилококков. Ведут так же,

как и определение КМАФАнМ. В качестве питательной среды используют

274

молочно-солевой или желточно-солевой агар. Культивирование проводят при 37 0С в течение 24…48 часов. При росте на желточно-солевом агаре вокруг колоний образуются перламутровые зоны помутнения агара, а на молочносолевом агаре – небольшие зоны пептонизации.

ЗАДАНИЕ № 5. Результаты экспериментов представить в таблицу 3:

Таблица 3 – Физиолого-биохимические особенности бактерий

Тест или свойство Результат

Морфология колоний

Наличие ОК-ВОССТ ферментов

Каталазы

Оксидазы

Дегидрогеназы

Протеолитическая активность

Амилолитическая активность

Образование сероводорода

Образование аммиака

Образование индола

Рост на среде Гисса, содержащей:

Глюкозу

Лактозу

Сахарозу

Мальтозу

Маннит Примечание: «+» или «-» - положительная или отрицательная реакция; «К» -

образование кислоты при сбраживании; «Г» - выделение газа при сбраживании.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

1.Назовите основные аспекты систематики бактерий.

2.Вид как основная единица систематики микроорганизмов.

3.Правила идентификации микроорганизмов

4.Характеристика физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов.

5.Выявление окислительно-восстановительных ферментов.

6.Утилизация микроорганизмами источников углерода.

7.Определение продукции гидролитических ферментов.

8.Утилизация микроорганизмами органических азотсодержащих веществ

Лабораторная работа №8

Тема: Общая характеристика метаболизма бактерий, особенности их биоэнергетики

МОЛОЧНОКИСЛОЕ, СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ (2 часа)

275

Цель: Изучить механизмы реакции молочнокислого и спиртового брожений, ознакомиться с микроорганизмами, инициирующими брожение.

Задачи:

1.Изучить механизм протекания спиртового брожения и морфологию его возбудителей.

2.Изучить механизм протекания и виды молочнокислого брожения, морфологию его возбудителей.

МОЛОЧНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ Материалы и оборудование: рассол, простокваша, ацидофилин, кефир,

оборудование для окрашивания препаратов, микроскопы.

ХОД РАБОТЫ:

ЗАДАНИЕ 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в молочнокислом брожении, сделать рисунок. Для ознакомления с бактериями молочнокислого брожения (гомоферментативное брожение) можно воспользоваться готовыми молочнокислыми продуктами (простокваша, ацидофилин, кефир) и рассолом (гетероферментативное брожение). Указанные продукты наносят петлей на предметное стекло и делают тонкий мазок. Окрашивают в течение 3-5 мин водным раствором метиленового синего.

ЗАДАНИЕ 2. Провести микроскопирование молочной плесени(гнилостных бактерий, многоклеточного мицелия), молочно-кислых бактерий.

ЗАДАНИЕ 3. Заполнить таблицу 4:

Таблица 4 – Характеристика процессов брожения

Виды брожения/окисления Условия Возбудители Субстраты Продукты Схема

Молочнокислое (гомеферментативное)

Молочнокислое (гетероферментативное)

СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ Материалы и оборудование: дрожжи пекарские, 20-% р-р сахарозы,

термостат, микроскоп, набор красок, предметные стекла.

ХОД РАБОТЫ:

ЗАДАНИЕ 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в спиртовом брожении, сделать рисунок. В колбу на 250 мл наливают 50 мл 20%-ного раствора сахарозы и около 1 г дрожжей, разведенных в 10 мл раствора сахарозы (20%). Закрывают и поддерживают температуру около 35-40°С в течение нескольких дней.

276

ЗАДАНИЕ 2. Провести микроскопирование культурных дрожжей рода

Saccharomyces и Schizosaccharomyces.

ЗАДАНИЕ 3. Заполнить таблицу5:

Таблица 5 – Характеристика процессов брожения

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

1.Какие условия необходимы для протекания брожения: спиртового, молочнокислого?

2.Назовите ферменты процессов брожения.

3.Какие микроорганизмы вызывают молочнокислое брожение? Чем отличается гомоферментативный процесс от гетероферментативного?

4.Назовите культурные расы дрожжей, вызывающих спиртовое брожение.

5.Каким способом можно обнаружить молочную кислоту?

6.Как можно получить культуру маслянокислых бактерий? Каковы особенности бактерий рода Clostridium?

Лабораторная работа №9

Тема: Общая характеристика метаболизма бактерий, особенности их биоэнергетики

МАСЛЯНОКИСЛОЕ, УКСУСНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ (2 часа)

Цель: Изучить механизмы реакции маслянокислого и уксуснокислого брожений, ознакомиться с микроорганизмами, инициирующими брожение.

Задачи:

1.Изучить механизм протекания маслянокислого брожения и морфологию его возбудителей.

2.Изучить особенности преобразования спирта в уксусную кислоту и морфологию уксуснокислых бактерий.

МАСЛЯНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ Материалы и оборудование: неочищенный картофель, мел, водяная баня,

термостат, 95%этиловый спирт, концентрированная серная кислота, фуксин, р- р Люголя, предметные стекла, спиртовки.

ХОД РАБОТЫ:

278

брожения/окисления

Окисление спирта в уксусную кислоту

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

1.Какие условия необходимы для протекания брожения: маслянокислого, уксуснокислого?

2.Назовите ферменты процессов брожения.

3.Какие микроорганизмы вызывают маслянокислое брожение?

4.Какие микроорганизмы вызывают уксуснокислое брожение?

5.В чем особенности жизнедеятельности чайного гриба?

6.Какие качественные реакции существуют для обнаружения масляной кислоты в культуральной среде?

7.Какие качественные реакции существуют для обнаружения уксусной кислоты в культуральной среде?

Лабораторная работа №10

Тема: Аэробное и анаэробное дыхание бактерий

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ АЗОТА (2 часа)

Цель: Изучить особенности процессов превращения микроорганизмами минеральных соединений азота.

Задачи:

1.Изучить особенности протекания процессов нитрификации (I, II фаза) и участвующих в них микроорганизмов.

2.Изучить особенности протекания процессов денитрификации и участвующих в них микроорганизмов.

3.Изучить особенности протекания процессов азотфиксации и участвующих в них микроорганизмов.

Материалы и оборудование: колбы с жидкой средой Эшби для культивирования азотфиксаторов, средой Виноградского для культивирования нитрификаторов, средой Гильтая для культивирования денитрификаторов, оборудование для окраски микропрепаратов, микроскопы.

ХОД РАБОТЫ:

ЗАДАНИЕ 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в процессах нитрификации, сделать рисунок. Для накопления нитрифицирующих бактерий пользуются питательной средой С. Н. Виноградского (г/л): для первой фазы нитрификации: (NH4)2 SO4 - 2,0 K2HPО4 - 1,0 MgSO4 - 0,5 NaCl - 2,0 FeSO4 -

279

0,4 CaCO3 - 5,0 . Для второй фазы нитрификации: NaNО2 - 1,0 Na2CO3 - 1,0 NaCl - 0,5 K2HPO4 - 0,5 MgSO4 - 0,5 FeSO4 - 0,4.

Среды стерилизуют и разливают в колбы слоем 1,0-1,5 см и заражают комочком парниковой почвы. Колбы закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 25-28 °С на 14–21-й день.

ЗАДАНИЕ 2. Провести микроскопирование скоплений овальных или кокковидных клеток Nitrosomonas (первая фаза) и коротких палочковидных клеток Nitrobacter (вторая фаза).

ЗАДАНИЕ 3. Изучить микроорганизмы, осуществляющие процессы денитрификации, сделать рисунок.

Для накопления денитрифицирующих бактерий приготовить следующую среду (в г/л): сегнетова соль – 20; KNO3 – 2,0; К2НРО4 – 0,5; MgSO4 · 7Н2О – 0,2; FeSO4 · 7Н2О – следы. Среду разливают высоким слоем в большие пробирки до края и стерилизуют.

ЗАДАНИЕ 4. Провести микроскопирование неспорообразующих сферических клеток или коротких палочек Paracoccus denitrificans (Bacterium denitrificans), P. stutzeri (Achromobacter stutzeri), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens.

ЗАДАНИЕ 5. Изучить микроорганизмы, участвующие в фиксации атмосферного азота, сделать рисунок. Для накопления свободноживущих азотфиксаторов используют среду Эшби. Состав питательной среды (г/л дистиллированной воды): маннит, глюкоза, или сахароза – 20,0; К2НРО4 – 0,2; MgSO4 – 0,2; NaCl – 0,2; K2SО4 – 0,1; СаСОз – 5,0.

Питательную среду, не стерилизуя, разливают в колбы объемом 100 – 150 мл, слоем 1 – 1,5 см и заражают парниковой почвой (1/3 чайной ложки). Колбы закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 28 – 30 °С. Через 5 – 7 суток на поверхности среды образуется коричнево-бурая пленка азотобактера. Жидкость в колбе пенится и издает запах масляной кислоты, что указывает на развитие в среде бактерий Cl. pasteurianum.

ЗАДАНИЕ 6. Провести микроскопирование поверхностной пленки. Наиболее распространены два вида азотобактера: Azotobacter chroococcum, Azotobacter vinelandii, Clostridium pasteurianum.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

1.Минерализация азота. Бактерии, участвующие в аммонификации белка.

2.Характеристика процессов нитрификации. Микроорганизмы, осуществляющие образование нитратов в почве.

5.Восстановление нитратов и нитритов в природе.

6.Денитрификация (диссимиляционная нитратредукция).

7.Ассимиляционная нитратредукция.

280

8.Азотфиксация свободноживущими микроорганизмами.

9.Ассоциативная азотфиксация.

10.Симбиотическая азотфиксация. Характеристика клубеньковых

бактерий.

11.Взаимодействие клубеньковых бактерий с растением-хозяином. Образование бактероидов.

12.Симбиотическая азотфиксация небобовых растений.

13.Химизм процессов азотфиксации.

Лабораторная работа №11

Тема: Регуляция метаболизма бактерий

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ СОЕДИНЕНИЙ УГЛЕРОДА (2 часа)

Цель: Изучить метаболизм бактерий на примере механизма брожения пектиновых веществ, брожения целлюлозы и морфологию возбудителей.

Задачи:

1.Изучить механизм брожения пектиновых веществ и морфологию его возбудителей.

2.Изучить особенности превращения целлюлозы в аэробных условиях и морфологию его возбудителей.

3.Изучить особенности брожения целлюлозы в анаэробных условиях и морфологию его возбудителей.

Материалы и оборудование: льняная соломка, высокие пробирки с ватными пробками, ножницы, нитки, пинцеты, водяная баня, кристаллвиолет, микроскопы, оборудование для окрашивания препаратов, среда Имшенецкого, среда Гетчинсона, почва, бумага.

ХОД РАБОТЫ:

ЗАДАНИЕ 1. Изучить микроорганизмы, участвующие в брожении пектиновых веществ, сделать рисунок. Для изучения брожения пектиновых веществ в лабораторных условиях воспроизводят процесс водяной мочки льняных стеблей.

ЗАДАНИЕ 2. Провести микроскопирование возбудителей брожения пектиновых веществ, сделать рисунок.

ЗАДАНИЕ 3. Изучить микроорганизмы, участвующие в разложении клетчатки (анаэробные условия).

Для получения накопительной культуры анаэробных форм целлюлозоразрушающих бактерий используют среду Имшенецкого. В круглую плоскодонную колбу вносят около 1-2 г фильтровальной бумаги или вату, и