mikrobiologiia

261

Рис. 3 – Форма колоний:

а – круглая; б – круглая с фестончатым краем; в – круглая с валиком по краю; г; д – ризоидная; е – с ризоидным краем; ж –амебовидная; з – нитевидная; и – складчатая;

к – неправильная; л – концентрическая; м – сложная

Форма колоний может быть круглой, неправильной, корневидной, эллипсовидной и т.д.

2.Размеры колоний. Колонии, имеющие диаметр более 4 мм являются крупными, от 2 до 4 мм – средними, от 1 до 2 мм – мелкими, менее 1 мм - точечными или росинчатыми.

3.Цвет колоний. Микроорганизмы, содержащие пигменты могут быть желтого, оранжевого, розового, кремового и др. цветов. Большинство микроорганизмов не содержат пигментов и растут на плотных средах в виде серовато-матовых колоний. Такие колонии называют бесцветными.

4.Рельеф (профиль) колоний. Рельеф или профиль колоний может быть плоским, выпуклым, куполообразным, смешанным - плоским с выпуклым центром, кратерообразным и др. (рисунок 4).

262

Рис. 4 – Профиль колоний:

а – изогнутый; б – кратерообразный; в – бугристый; г – врастающий в агар; д – плоский; е – выпуклый; ж – каплевидный; з - конусовидный

5. Поверхность колоний может быть гладкой, блестящей, шероховатой, морщинистой, извилистой и т.д. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый». Механизм формирования гладких и шероховатых форм колоний обусловлен различием процессов клеточного деления. Микробные клетки в колониях S-форм располагаются, соприкасаясь своими боковыми поверхностями, клетки R-форм, сохраняя при делении цитоплазматические мостики, образуют цепочки, которые, накладываясь друг на друга, обусловливают шероховатую поверхность и неровный край колонии.

Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссоциации. Явление диссоциации у патогенных микробов наблюдается под действием антибиотико- и химиотерапии, факторов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также факторов внешней среды. Среди шероховатых форм колоний различают: складчатые, гирозные, по виду напоминающие исчерченную извилинами поверхность мозга; бородавчатые, концентрически или радиально исчерченные; шагреневые, т. е. мелкозернистые.

6. Характер края колоний, его разновидности изображены на рисунке 5.

Рис. 5 – Край колоний:

а- гладкий; б – волнистый; в – зубчатый; г – лопастный; д – неправильный; е – реснитчатый;

ж– нитчатый; з – ворсинчатый; и – ветвистый

Край может быть ровным (гладким); волнистым; локонообразным (нитчатым); лопастным; бахромчатым; зазубренным; корневидным (ветвистым)

идр.

7.Прозрачность колоний

Колонии бывают прозрачные, полупрозрачные и непрозрачные.

263

8.Структура колоний бывает однородная (гомогенная) и неоднородная (гетерогенная). Неоднородные колонии могут быть мелко- и крупнозернистыми, радиально или концентрически исчерченными, чешуйчатыми и др. определяется в проходящем свете при слабом увеличении микроскопа, суженой диафрагме или при несколько опущенном конденсоре. У пигментированных колоний и колоний, не пропускающих света, она не определяется.

По характеру структуры различают следующие виды колоний:

1.гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

2.зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелко- и грубозернистые;

3.нитевидные или волокнистые, характеризующиеся наличием длинных, густо переплетающихся нитей в толще колонии.

Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой.

9.Консистенция колоний определяется при приготовлении препаратов для микроскопического анализа.

Она определяет ее физическое состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей.

По характеру консистенции колонии бывают:

1.пастообразные, легко снимающиеся и размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;

2.вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей;

3.волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соответствующей величине и форме колонии;

4.хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.

Изучение культуральных свойств выросших в чашках колоний на

жидких питательных средах.

Характер роста микробов менее разнообразен, чем на плотных питательных средах. Однако и здесь выявлены следующие формы роста бактерий.

Рост бактерий с равномерным помутнением среды, цвет которой остается неизмененным или изменяется в соответствии с цветом водорастворимого пигмента, образующегося в культуре микроба. Такой рост характерен для многих патогенных бактерий, относящихся к группе

факультативных анаэробов.

Придонный рост бактерий характеризуется образованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой. Осадок может быть скудным или обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев, по консистенции вязким, слизистым, хрупким или

264

пастообразным. Питательная среда над осадком может быть прозрачной или мутной. Цвет осадка и среды, находящейся над ним, определяется наличием пигмента, продуцируемого культурой микробов. Если культура пигмента не образует, цвет среды не изменяется, а осадок приобретает, как правило, сероватобелый или желтоватый цвет. Придонный рост специфичен для бактерий с анаэробным типом дыхания.

Пристеночный рост бактерий выражается в том, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно прозрачной. Бактерии растут, образуя более или менее крупные рыхлые хлопья или, наоборот, компактные зерна, прикрепленные к внутренней поверхности стенок сосуда, с которых в зависимости от вида бактерий снимаются легко или с трудом.

Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности жидкой питательной среды пленки, внешний вид и характер которой могут быть различны:

•пленка тонкая, нежная, бесцветная, имеет вид едва заметного налета,

исчезающего при встряхивании пробирки и взбалтывании среды;

•пленка влажная, толстая, хорошо видимая простым глазом, вязкой, слизистой консистенции, прилипает к петле и тянется за ней;

•пленка плотная, сухая, внешним видом напоминает кусочки кожи и при попытке взятия из нее материала снимается целиком в виде круглого диска, соответствующего диаметру пробирки:

•пленка плотная, сухая, со сморщенной, а иногда бородавчатой поверхностью, краями прикрепленная к стенкам сосуда; при взбалтывании жидкости или прикосновении бактериальной петли разбивается на кусочки, погружающиеся вглубь жидкости.

Цвет пленки, как и питательной среды, зависит от пигмента, вырабатываемого растущей культурой микробов. Рост бактерий в виде поверхностной пленки характерен для микробоваэрофилов.

Изучение культуральных свойств выросших в чашках колоний на полужидких питательных средах. Для выявления особенностей микробного роста на полужидкой питательной среде исследуемую культуру засевают в столбик 0,2-0,5% полужидкого агара. Для того, чтобы особенности роста проявлялись наиболее четко, прокол среды делают в непосредственной близости к стенке пробирки. Посев, произведенный таким образом, дает возможность выявить подвижные расы микробов и дифференцировать их от неподвижных.

Подвижные микробы в столбике полужидкого агара вызывают выраженное помутнение, распространяющееся более или менее равномерно по всей толщине среды.

Неподвижные формы микробов растут только по ходу прокола среды, напоминая сосульки цилиндрической или конической формы. При этом окружающая среда остается совершенно прозрачной.

ЗАДАНИЕ 2. Приготовить из описанных колоний фиксированные мазки и окрасить, зарисовать микроскопическую картину и сделать вывод о

265

качественном составе микрофлоры бактериальной смеси.

Изучение морфологических свойств микроорганизмов. Готовят фиксированные препараты бактерий по методике, изложенной в разделе, и окрашивают их простыми методами или по методу Грама. Рассматривают препараты с объективом х90 при максимальном освещении.

Оформление и анализ результатов исследований. Кратко законспектировать теоретический материал. Описать культуральные свойства выросших в чашках Петри колоний. Зарисовать микроскопические картины выделенных из различных объектов чистых и накопительных культур с учетом морфологических особенностей каждого микроорганизма. Под каждым рисунком подписать увеличение препарата. Сделать соответствующие выводы.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

1.Каким образом можно выделить накопительную культуру анаэробных бактерий?

2.Охарактеризуйте методы выделения чистых культур микроорганизмов, основанные на их механическом разделении.

3.В чем заключается сущность биологических методов выделения чистых культур патогенных микроорганизмов?

4.По каким признакам описывают культуральные свойства микроорганизмов, выросших на плотных средах в чашках Петри?

5.Перечислите основные этапы пересева микроорганизмов из пробирки в пробирку.

6.Изучение культуральных свойств выросших в чашках колоний на жидких / полужидких питательных средах

7.Изучение морфологических свойств микроорганизмов

Лабораторная работа №6

ДЕЙСТВИЕ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ (2 часа)

Цель: Изучить влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность микроорганизмов.

Задачи:

1.Изучить влияние УФсвета на бактерии.

2.Изучить факторы чувствительности бактерий к УФсвету.

3.Изучить влияние антибиотиков на микроорганизмы.

4.Изучить факторы чувствительности / устойчивости бактерий к антибиотикам.

Материалы и оборудование: культуры бактерий на плотной и жидкой питательной среде, УФ-облучатель, диски с антибиотиком, пробирки, физ. расвор, бактериологические петли, чистая питательная среда в Чашках Петри, лупа.

267

бумажных дисков

затемненная часть - рост бактерий, светлая зона - отсутствие видимого роста

Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к данному антибиотику.

ЗАДАНИЕ 3. Провести эксперимент по определению чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений антибиотика в жидкой полноценной питательной среде.

Метод серийных разведений антибиотика в жидкой питательной среде позволяет путем определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика количественно охарактеризовать его активность в отношении исследуемых микроорганизмов.

Работу начинают с приготовления растворов антибиотика. Для этого в ряд стерильных пробирок наливают по 2 мл жидкой полноценной питательной среды. В первую пробирку вносят 2 мл исходного раствора антибиотика (концентрация препарата - 500, 1000 мкг/мл) и тщательно перемешивают смесь. После этого 2 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую, повторяя перемешивание, далее 2 мл из второй пробирки переносят в третью и т. д. Из предпоследней пробирки 2 мл раствора антибиотика удаляют. При таком способе разведения в каждой пробирке будет содержаться по 2 мл раствора антибиотика и в каждой последующей пробирке его концентрация будет в два раза меньше, чем в предыдущей. Среда в последней пробирке раствора антибиотика не содержит и является контрольной для роста культуры.

После приготовления разведений во все пробирки вносят по 0,1 мл взвеси клеток с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 105 - 104 клеток (рисунок 7). По 0,1 мл исследуемой культуры

268

Рисунок 7 – Схема эксперимента по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотику методом серийных разведений препарата в жидкой

питательной среде

Пробирки энергично перемешивают и помещают на 18-20 часов для выращивания при оптимальной температуре. Учет результатов проводят двояко: вначале просматривают пробирки, чтобы по помутнению среды определить наличие роста микроорганизмов. Помутнение среды указывает на наличие высокой численности бактерий (более 107 кл/мл). Среда в пробирках, в которых антибиотик находится в концентрациях, достаточных для подавления роста микроорганизмов, остается прозрачной. Наименьшая концентрация антибиотика, при которой размножение микроорганизмов уже не происходит, а содержимое пробирок остается прозрачным, соответствует наименьшей ингибирующей концентрации данного антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма и рассматривается как бактериостатическая, что означает задержку роста бактерий, но не наличие их гибели. Для определения бактерицидной концентрации исследуемого антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма (это значит, концентрации препарата, в которой он вызывает гибель клеток) проводят посев бактериологической петлей из пробирок, содержимое которых не помутнело, на полноценную питательную агаризованную среду. Отсутствие роста свидетельствует, что в данной пробирке микроорганизмы полностью убиты данным антибиотиком.

Метод серийных разведений антибиотика в агаризованной среде удобен

269

тем, что позволяет в одном опыте проверить чувствительность к данному антибиотику нескольких микроорганизмов. Разведения антибиотика готовят в стерильной агаризованной среде. Для этого в нее добавляют требуемое количество исходного раствора антибиотика, тщательно перемешивают и заливают в стерильные чашки Петри. После застывания агара дно чашки с наружной стороны делят маркером на стора. Каждую исследуемую культуру засевают штрихом с помощью бактериологической петли на отдельный стор в чашки с разными концентрациями антибиотика.

Чашки помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста и развития изучаемых бактерий и инкубируют в течение 40-72 часов. Результаты учитывают по наличию или отсутствию роста бактерий в сравнении с ростом на среде в контрольной чашке. Бактерии считаются чувствительными к антибиотику в такой его концентрации, при которой их рост полностью подавляется.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

1.Классификация химических соединений по характеру действия на

клетку.

2.Назовите физические факторы, оказывающие выраженное действие на микроорганизмы.

3.Как определяют действие физических и химических факторов на микроорганизмы?

4.Методы изучения действия УФ-света на бактерии.

5.Факторы, определяющие выживаемость бактерий от дозы УФоблучения. Летальный эффект УФ-лучей. От чего он зависит?

6.Зависимость выживаемости клеток от состава среды.

7.Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

8.На чем основано определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков?

9.На чем основано определение чувствительности к антибиотикам методом серийных разведений?

Лабораторная работа №7

Тема: Питание микроорганизмов

ИЗУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ (2 часа)

Цель: Изучить физиолого-биохимические свойства микроорганизмов.

Задачи:

1.Освоить основные этапы идентификации микроорганизмов.

2.Научиться проводить основные физиолого-биохимические тесты с микроорганизмами:

- наличие каталазной активности; - наличие протеолитической активности;

270

-наличие амилолитической активности;

-наличие сахаролитической активности;

-образование сероводорода;

-образование аммиака;

-образование индола.

Материалы и оборудование: определитель бактерий Берги; бактериальная культура; 1% р-р дигидрохлорида тетраметил-п- фенилендиамина; 0,5 мл 3 % раствора 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорида (ТТХ); среды Гисса; бактериологическая петля; 96% спирт, питательная мясопептонная среда с желатиной; обезжиренное (0,3 - 0,5 %) молоко; полноценная питательная среда, которая содержит 0,2 % растворимого крахмала; раствор Люголя; жидкая полноценная среда, содержащая 0,01 % триптофана; реактива Эрлиха (парадиметиламинобензальдегид, растворенный в этаноле и соляной кислоте); индикаторные бумажки, пропитанные раствором уксуснокислого свинца; индикаторные бумажки, пропитанные реактивом Крупа.

ХОД РАБОТЫ:

ЗАДАНИЕ № 1. Отобрать из рассева накопительной культуры 2 - 3 изолированные колонии различной морфологии и описать их свойства.

ЗАДАНИЕ № 2. Отсеять на поверхность скошенной агаризованной среды в пробирке одну из отобранных и описанных колоний.

ЗАДАНИЕ № 3. Провести визуальный и микроскопический контроль описанной культуры бактерий.

ЗАДАНИЕ № 4. Изучить методику и провести постановку предложенных физиолого-биохимических тестов: наличие каталазной, протеолитической, амилолитической, сахаролитической активности; образование сероводорода, аммиака, индола.

Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов

Сахаролитические свойства микроорганизмов. Под действием сахаролитических ферментов бактерий сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления являются газообразные вещества: СO2 и Н2. Характерно, что различные виды и даже разновидности микробов относятся по-разному к одним и тем же сахарам.

Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий засевают в питательные среды Гисса, называемые также «пестрым» рядом. «Пестрый» ряд Гисса содержит обычно 5 пробирок: с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При некоторых исследованиях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и