Volume1
.pdf
328 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.4.26.СборкагистоновогооктамеранаДНК.ГистоновыйдимерH3–H4идимерH2A–H2Bобразуются за счет взаимодействия типа «рукопожатия». Тетрамер H3–H4 образуется и связывается с ДНК. После этогодвадимераH2A–H2Bприсоединяютсяизавершаютпостроениенуклеосомы.Гистоныокрашены, какинарис.4.24и4.25.Обратитевнимание,чтовсевосемьN-концевыххвостовгистоновкакбывисят наимеющейформудискастержневойструктуре.Ихконформацииоченьгибкие.Внутриклеткиреакции сборки нуклеосомы, показанные здесь, опосредуются белками, называемыми гистоновыми шаперонами(histoneshaperonproteins),илинаставникамигистонов,одниизкоторыхспецифичныкгистонам H3–H4,адругие—кгистонамH2A–H2B.(ПереработанонаосновеиллюстрацийJ. Waterborg.)
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 329
Рис. 4.27. Изгиб ДНК в нуклеосоме. Спираль ДНК делает 1,7 тугих оборота вокруг гистонового октамера.Наэтойсхемепоказано,какмалаябороздка сжимается на внутренней части витка. Благодаря некоторым структурным особенностям молекулы ДНК,обозначенныединуклеотидыпредпочтительно располагаются в таких суженных местах малой бороздки,чтопозволяетобъяснить,почемуопределенные последовательности ДНК прочнее других прикрепляютсякстержнюнуклеосомы.
Несмотря на высокую консерватив- ность стержневых гистонов, эукариотиче- ские организмы содержат, хотя и в мень-
ших количествах, также стержневые гистоны специализированного варианта, которые отличаются по последователь-
ности аминокислот от обычных. Как мы увидим, эти варианты, вкупе с удиви- тельно большим разнообразием ковалентных модификаций, которыми могут быть дополнены гистоны в нуклеосомах, делают возможным все множество различных структур хроматина, которое требуется для функционирования ДНК в клетках высших эукариот.
4.2.10. Нуклеосомы обладают динамичной структурой и часто подвергаются изменениям, катализируемым АТР-зависимыми комплексами перестройки хроматина
Многие годы биологи полагали, что, однажды сформировавшись в опреде- ленной позиции на ДНК, нуклеосома остается закрепленной за этим местом из-за очень прочного соединения между ее стержневыми гистонами и ДНК. Будь это так, это создало бы проблемы генетическим механизмам считывания, которые, в принципе, требуют быстрого доступа ко многим специфическим последователь- ностям ДНК, а также машинам транскрипции и репликации ДНК, которым нужно быстро продвигаться по хроматину. Но кинетические исследования показывают, что ДНК в отдельно взятой нуклеосоме разматывается с каждого конца со скоростью приблизительно 4 раза в секунду и остается голой на 10–50 миллисекунд, после чего частично развернутая структура вновь «закрывается» в нуклеосому. Таким образом, бóльшая часть ДНК в выделенной нуклеосоме, в принципе, доступна для связывания с другими белками (рис. 4.28).
Для находящегося в клетке хроматина явно необходимо дальнейшее ослабление ДНК-гистоновых контактов, потому что клетки эукариот содержат большое разнообразие АТР-зависимых комплексов перестройки хроматина. В этих комплексах субъединица, которая гидролизует ATP, эволюционно родственна ДНК-хеликазам (обсуждаемым в главе 5) и связывается как с белковым стержнем нуклеосомы, так и с двунитевой ДНК, намотанной на него. Используя энергию гидролиза ATP для перемещения ДНК по стержню, эта субъединица временно изменяет структуру нуклеосомы, ослабляя прикрепление ДНК к гистоновому стержню. Посредством повторяющихся циклов гидролиза ATP такие комплексы перестройки могут катали-
330 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 4.28. Динамичные нуклеосомы. Измерения кинетики показывают, что ДНК в отдельно взятой нуклеосоме удивительно динамична: она быстро разматывается и затем вновь оборачивается вокруг нуклеосомногостержня.Каквидно,благодаряэтомубольшаячастьсвязаннойснейпоследовательности ДНКдоступнадлядругихсвязывающихсясДНКбелков.(ДанныевзятыизG. LiandJ. Widom,Nat.Struct. Mol.Biol.11:763–769,2004.СблагосклонногодозволенияMacmillanPublishersLtd.)
зировать скольжение нуклеосомы и, продвигая таким способом стержень нуклеосомы по двойной спирали ДНК, делают нуклеосомную ДНК доступной для других белков клетки (рис. 4.29). Кроме того, за счет кооперативного взаимодействия с отрицательно заряженными белками, которые выступают в роли гистоновых шаперонов, некоторые комплексы перестройки способны удалять из нуклеосомы либо весь стержень, либо часть его — катализируя либо замену гистонов H2A–H2B, либо полное удаление октамерного стержня из катушки ДНК (рис. 4.30).
Клетки содержат десятки различных АТР-зависимых комплексов перестройки хроматина, которые специализируются на выполнении различных задач. По большей части это крупные белковые комплексы, которые могут содержать 10 и более субъединиц. Деятельность таких комплексов подлежит тщательному управлению со стороны клетки. Когда гены включаются и выключаются, комплексы перестройки хроматина доставляются к определенным областям ДНК, в которых они оказывают локальное действие на структуру хроматина (обсуждаем в главе 7; см. также рис. 4.46 далее).
Как упоминалось ранее, для большинства последовательностей ДНК, находящихся в хромосомах, экспериментально показано, что нуклеосома может занять любую из множества позиций относительно последовательности ДНК. Самое важное влияние на расположение нуклеосомы, кажется, оказывает присутствие на молекуле ДНК других сильно связанных с ней белков. Некоторые связанные
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 331
Рис. 4.29. Скольжение нуклеосомы, катализируемое ATP-зависимыми комплексами перестройки хроматина. Используя энергию гидролиза ATP, комплекс перестройки, как думают, продвигает ДНК связанной им нуклеосомы и ослабляет ее прикрепление к стержню нуклеосомы. Таким образом, каждыйцикл,состоящийизсвязыванияATP,гидролизаATPивысвобожденияпродуктов—ADPиPi, — перемещает ДНК по гистоновому октамеру в направлении стрелки, показанной на этом рисунке. Для осуществления представленного на рисунке скольжения в нуклеосоме требуется много таких циклов. (См.такжерис.4.46,б.)
Рис.4.30.Удалениенуклеосомыизаменагистонов,катализируемыеАТР-зависимымикомплексами перестройкихроматина.Засчеткооперативноговзаимодействиясопределеннымигистоновымишапе- ронаминекоторыекомплексыперестройкихроматинамогутудалятьдимерыH2A–H2Bизнуклеосомы (верхний ряд реакций) и заменять их димерами, которые содержат иной гистон, такими, например, как димер H2AZ–H2B (см. рис. 4.41). Другие комплексы перестройки привлекаются к определенным участкамнахроматине,стемчтобыполностьюудалитьгистоновыйоктамери/илизаменитьегоиным стержнемнуклеосомы(нижнийрядреакций).
332 Часть 2. Основные генетические механизмы
белки предпочитают формирование нуклеосомы «бок о бок» с ними. Другие создают препятствия, которые вынуждают нуклеосому передвигаться в позицию «между ними». Поэтому точные позиции нуклеосом на отрезке ДНК зависят главным образом от присутствия и природы других белков, связанных с ДНК. Благодаря присутствию АТР-зависимых комплексов перестройки взаимное расположение нуклеосом на ДНК может быть очень динамичным и быстро изменяться согласно потребностям клетки.
4.2.11. Нуклеосомы обычно упакованы в компактную хроматиновую фибриллу
Хотя на хромосомной ДНК и образуются чрезвычайно длинные нити нуклеосом, хроматин в живой клетке, по всей вероятности, лишь изредка принимает развернутую форму «бусин на нити». Вместо этого, нуклеосомы укладываются друг на друга и образуют правильный строй, в котором ДНК уплотнена еще сильнее. Таким образом, когда ядра очень мягко лизируют на сетке электронного микроскопа, основная доля хроматина наблюдается в виде нити (фибриллы) с диаметром около 30 нм, что значительно толще, чем хроматин в форме «бусин на нити» (см.
рис. 4.22).
Как же нуклеосомы упакованы в 30-нм хроматиновой фибрилле? Этому вопросу еще не найден окончательный ответ, однако получена важная информация о структуре фибриллы. В частности, высокоразрешающие структурные исследования были проведены на гомогенных коротких нитях нуклеосом, приготовленных из очищенных гистонов и очищенных молекул ДНК. Структура тетрануклеосомы, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа, была положена в основу зигзагообразной модели укладки нуклеосом в 30-нм хроматиновой фибрилле (рис. 4.31). Но криоэлектронная микроскопия более длинных нитей нуклеосом говорит в пользу совершенно иной, соленоидальной, структуры с частично вклинивающимися друг в друга нуклеосомами (рис. 4.32).
Что заставляет нуклеосомы столь плотно укладываться друг с другом в 30-нм хроматиновой фибрилле? Одним важным фактором выступают связи между нуклеосомами, образованные гистоновыми хвостами, в особенности хвостами гистона H4 (рис. 4.33). Другой важный фактор — дополнительный гистон, который часто пребывает в отношении 1:1 со стержнями нуклеосом, известный как гистон Н1. Этот так называемый связующий гистон крупнее, чем каждый из стержневых гистонов, и его намного сильнее «потрепало» в ходе эволюции. С каждой нуклеосомой связывается одна молекула гистона Н1, который контактирует и с ДНК и,
сбелком, видоизменяя тем самым траектирию выхода ДНК из нуклеосомы. Хотя еще не выяснено во всех подробностях, как Н1 уплотняет нуклеосомы в 30-нм фибриллы, изменение траектории выхода ДНК выглядит определяюще важным фактором для того, чтобы нуклеосомная ДНК входила в сцепление и замыкалась
собразовыванием 30-нм фибриллы (рис. 4.34). В организмах большинства эукариот синтезируется несколько форм белка гистона Н1 с родственными, но весьма различными последовательностями аминокислот.
Возможно, что 30-нм структура, обнаруженная в хромосомах, представляет собой постоянно меняющуюся мозаику из нескольких разновидностей Н1. Например, линкерный гистон семейства Н1 присутствовал в структуре исследуемых нуклеосом, представленных на рис. 4.32, но отсутствовал в тетрануклеосоме, пред-
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 333
Рис.4.31.Зигзагообразнаямодель30-нмхроматиновойфибриллы. а)Конформациядвухизчетырех нуклеосом, входящих в тетрануклеосому, восстановленна по структуре, определенной рентгеноструктурным анализом. б) Схематическое изображение полной тетрануклеосомы; четвертая нуклеосома невидна,будучисовмещенаснижнейнуклеосомойирасположенапозадинеенаэтойсхеме.в)Схематическоепредставлениевозможнойзигзагообразнойструктуры,котораямоглабыобъяснитьстроение
30-нмхроматиновойфибриллы.(ПереработаноизC. L. Woodcock,Nut.Struct.Mol.Biol.12:639–640,2005.
СвеликодушногоразрешенияMacmillanPublishersLtd.)
Рис.4.32.Модель30-нмхроматиновойфибриллытипагребенчатогосоленоида.а)Изображения,на которых использовано схематическое изображение нити с закодированными цветом нуклеосомами, чтобы показать, как образуется такой соленоид. б) Схематическое изображение конечной структуры навидеа.в)Структурнаямодель.Этамодельпостроенанаосновеполученнойспомощьювысокоразрешающей криоэлектронной микроскопии структуры нуклеосом, реконструированных из очищенных гистонов и молекул ДНК определенной длины и последовательности. Как нуклеосомные октамеры, такилинкерныйгистон(обсудимниже)былииспользованыдляполучениярегулярноповторяющихся структур, содержащих до 72 нуклеосом. (Переработано из P. Robinson, L. Fairall, V. Huynh and D. Rhodes, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103:6506–6511,2006.СлюбезногоразрешенияNationalAcademyofSciences.)
334 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 4.33. Гипотетическая модель роли гистоновых хвостов в образовании 30-нм фибрилл. а) На этойиллюстрациисхематическипоказаныприблизительныеточкивыходавосьмигистоновыххвостов (поодномуоткаждогогистоновогобелка),которыеотходятоткаждойнуклеосомы.Фактическаяструктурапредставленавправойчастирисунка.Вполученнойсвысокимразрешениемструктуренуклеосомы хвостывзначительноймеребесструктурны,чтопредполагаетихчрезвычайнуюгибкость.б)Гипотетическая модель, показывающая, как гистоновые хвосты могут помогать упаковывать нуклеосомы в 30-нм фибриллы.Этамодельопирается1)наэкспериментальныеданные,чтогистоновыехвостыспособствуют формированию 30-нм фибрилл, и 2) на определенную с помощью рентгеновской кристаллографии структурунуклеосомы,вкоторойхвостыоднойнуклеосомынаходятсявконтактесгистоновымстержнем соседнейнуклеосомывобразованнойимикристаллическойрешетке.
ставленной на рис. 4.31. Более того, ранее у нас была возможность убедиться в том, что линкерная ДНК, которая соединяет смежные нуклеосомы, может варьировать по длине; такие различия в длине связок, вероятно, привносят местные возмущения в структуру. А присутствие многих других связывающихся с ДНК белков, равно как и белков, которые связываются непосредственно с гистонами, несомненно, привносит важные дополнительные особенности в любое сомножество нуклеосом.
Заключение
Ген — некоторая последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, кото- рая служит функциональным элементом для производства белка, структурной РНК или же каталитической либо регуляторной молекулы РНК. Кодирующие
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 335
Рис.4.34.Каксвязующийгистонсвязываетсяснуклеосомой.Показаныположениеиструктураглобу-
лярной области гистона Н1. Как видно, эта область удерживает дополнительные 20 пар нуклеотидов ДНК,гдепоследняяотходитотстержнянуклеосомы.СвязываниетакоготипагистономН1,какдумают, являетсяважнымдляформирования30-нмхроматиновоговолокна.ДлинныйС-концевойхвостгистона Н1нуженемутакжеидлявысокоаффинногосвязываниясхроматином,нониегоположение,нипозиция N-концевого хвоста не известны. Изображение а схематично, б — модель структуры. (Изображение б заимствованоизD. Brown,T. IzardandT. Misteli,Nat.Struct.Mol.Biol.13:250–255,2006.Слюбезногораз- решенияMacmillanPublishersLtd.)
белок гены эукариот обычно состоят из вереницы чередующихся интронов и экзонов, связанной с регуляторными областями ДНК. Хромосома образуется из единственной и чрезвычайно длинной молекулы ДНК, которая содержит линейную группу множества генов. Геном человека содержит 3,2·109 пар нуклео- тидов ДНК, разделенных на 22 различные аутосомы и 2 половые хромосомы. Только малая доля этой ДНК кодирует белки или молекулы функциональной РНК. Молекула хромосомной ДНК содержит также и три другие важные в функциональном отношении последовательности нуклеотидов: точки начала репликации (сайты инициации) и теломеры позволяют молекуле ДНК эффек- тивно реплицироваться, тогда как в центромерах дочерние молекулы ДНК при-
крепляются к митотическому веретену деления, что обеспечивает их точное расхождение по дочерним клеткам во время М-фазы клеточного цикла.
ДНК эукариот тесно связана с равной по весу массой гистонов, которые формируют повторяющиеся массивы ДНК-белковых частиц, названных нуклео- сомами. Нуклеосома состоит из октамерного гистонового стержня гистоновых белков, который обвит двойной спиралью ДНК. Нуклеосомы разделены проме- жутками около 200 пар нуклеотидов и обычно совместно упакованы (с помощью молекул гистона Н1) в квазирегулярное множество, образующее 30-нм хрома- тиновую фибриллу. Несмотря на высокую степень уплотнения хроматина, его структура должна быть очень динамичной — чтобы сохранялась возможность доступа к ДНК. В самой нуклеосоме происходит некоторое самопроизвольное раз-
матывание и повторное наматывание ДНК; однако общая стратегия обратимого изменения локальной структуры хроматина является прерогативой движимых гидролизом ATP комплексов перестройки хроматина. Клетки содержат богатый набор таких комплексов, которые нацеливаются на определенные области хро- матина в надлежащие моменты времени. Комплексы перестройки сотрудничают
336 Часть 2. Основные генетические механизмы
с гистоновыми шаперонами, что позволяет им передвигать нуклеосомные стержни, воссоздавать их из различных наборов гистонов или даже полностью удалять их из нуклеосом, с тем чтобы высвободить связанную с ними ДНК.
4.3. Управление структурой хроматина
Описав принципы упаковки ДНК в нуклеосомы и образования хроматинового волокна, мы обратим наш взор на механизмы, которые создают различные структуры хроматина в различных областях генома клетки. Теперь мы знаем, что механизмы такого типа используются для управления многими генами в геномах эукариот. Самое главное, некоторые типы структуры хроматина могут быть унаследованы; то есть структура может быть непосредственно передана от клетки ее потомкам. Поскольку такого рода клеточная память основывается на унаследованной структуре белка, а не на изменении последовательности ДНК, она относится к одной из форм эпигенетического наследования. Приставка epi в переводе с греческого означает «на» и соответствует сути механизма, потому что эпигенетика представляет собой форму наследования, которая накладывается на генетическое наследование, основанное на ДНК (рис. 4.35).
Рис. 4.35. Сравнение генетического наследования с эпигенетическим наследованием, проводимое по структурам хроматина. Генетическое наследование основано на прямом наследовании нуклеотидных последовательностей ДНК в ходе репликации ДНК. Изменения в последовательности ДНК не только точно передаются от соматической клетки всем ее потомкам, но также — через зародышевые клетки — от одного поколения другому. Область генетики, рассматриваемая в главе 8, основывается на наследовании таких изменений между поколениями. Представленная здесь схема наследования эпигенетическоготипаосновананадругихмолекулах,связанныхсДНК,ипоэтомутакоенаследование менееустойчиво,чемизменениевпоследовательностиДНК;вчастности,эпигенетическаяинформация обычно(ноневсегда)стираетсявовремяобразованияяйцеклетокисперматозоидов.
Вэтойглавеобсуждаетсятолькоодинэпигенетическиймеханизм,основанныйнанаследованииструктур хроматина. Другие эпигенетические механизмы будут представлены в главе 7, которая посвящена регулированиюэкспрессиигенов(см.рис.7.86).
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 337
В главе 7 мы представим множество различных способов регулирования экспрессии генов. Там мы обсуждаем эпигенетическое наследование подробно и представляем несколько различных механизмов, которые его обеспечивают. Здесь же нас интересует только один из таких механизмов, основанный на структуре хроматина. Мы начнем этот параграф с введения в наследуемые структуры хроматина, а затем опишем основу для них — ковалентную модификацию гистонов в нуклеосомах. Мы увидим, что такие модификации служат опознавательными участками для белковых модулей, которые приносят определенные белковые комплексы к соответствующим областям хроматина и таким образом оказывают определенные воздействия на экспрессию генов или запускают другие биологические функции. За счет таких механизмов структура хроматина играет ключевую роль в развитии, росте и поддержании жизнедеятельности организмов эукариот, в том числе и наших с вами бренных тел.
4.3.1. Некоторые ранние домыслы и предположения о структуре хроматина
Тридцать лет назад гистоны считались относительно неинтересными белками. Было известно, что нуклеосомы охватывают всю ДНК хромосом и, как думали, существуют для того, чтобы обеспечить упаковку огромного количества ДНК, имеющегося во многих ядерных клетках, в компактные хромосомы. Основываясь на том, что было известно из опытов над бактериями, многие ученые полагали, что регулирование генов у эукариот происходит в обход нуклеосомы, считая нуклеосомы «безучастными обывателями».
Но были причины бросить вызов данному мнению. Так, например, биохимики установили, что хроматин млекопитающих состоит из приблизительно равной массы гистоновых и негистоновых белков. Это может говорить о том, что в среднем каждые 200 пар нуклеотидов ДНК в наших клетках связаны с более чем 1 000 аминокислот негистоновых белков (то есть масса белка эквивалента полной массе гистонового октамера плюс гистона Н1). Теперь мы знаем, что многие из этих белков связываются с нуклеосомами, и их обилие могло бы предполагать, что гистоны являются чем-то более существенным, нежели только «упаковочным материалом».
Вторая причина оспорить точку зрения, согласно которой гистоны не существенны для регуляции генов, основывалась на удивительно медленных темпах эволюционного изменения в последовательностях четырех стержневых гистонов. Ранее упомянутый факт, что последовательности гистона H4 млекопитающих и гороха различаются только двумя аминокислотами, подразумевает, что замена почти любой из 102 аминокислот в последовательности гистона H4 должна быть губительна для этих организмов. Какого рода процесс мог сделать жизнь организма настолько чувствительной к точной структуре стержня нуклеосомы, что только две аминокислоты заменились за более чем 500 миллионов лет случайной изменчивости, сопровождаемой естественным отбором?
Есть и последнее, но не менее важное обстоятельство: сочетание генетики и цитологии показало, что специфическая форма хроматина заглушает гены, которые она упаковывает, безотносительно к последовательности нуклеотидов, а значит, это способ хранения генетической информации, который непосредственно наследуется обеими дочерними клетками при делениии материнской клетки. Именно к этому предмету мы и обратимся далее.