Volume1

278 Часть 1. Введение в мир клетки

Глава 3. Белки 279

Один из таких насосов, ATP-синтаза, использует градиент концентрации протонов, устанавливаемый за счет процессов переноса электронов, для выработки большей части ATP, используемой в живом мире. Этот повсеместный насос играет центральную роль в преобразовании энергии, и мы непременно изучим его трехмерную структуру и обсудим механизм его работы в главе 14.

3.2.28.  Часто белки образуют крупные комплексы, из которых получаются настоящие белковые машины

Крупные белки, состоящие из многих доменов, способны выполнять более сложные функции, чем маленькие, однодоменные белки. Однако наиболее впечатляющие задачи выполняют крупные белковые ансамбли, образованные из множества белковых молекул. Теперь, когда имеется возможность воссоздать большинство биологических процессов в бесклеточных системах в лабораторных условиях, ясно, что все основополагающие процессы в клетке — такие как репликация ДНК, синтез белка, отпочковывание пузырьков или трансмембранная передача сигналов — катализируются точно согласованными, связанными воедино наборами из 10 и более белков. В большинстве таких белковых машин энергетически благоприятная реакция, например гидролиз связанных нуклеозидтрифосфатов (ATP или GTP), приводит к упорядоченной серии конформационных изменений в одной или нескольких отдельных белковых субъединицах, что позволяет всему ансамблю белков перемещаться согласованно. Таким же образом, каждый фермент может быть непосредственно перемещен в очередную, надлежащую ему, позицию, по мере того как машина катализирует последовательную цепь реакций, одну за другой. Именно это происходит, например, при синтезе белка на рибосоме (рассматривается в главе 6) или при репликации ДНК — когда большой многобелковый комплекс быстро передвигается по ДНК (рассматривается в главе 5).

В ходе эволюции клетки создали белковые машины по той же причине, по которой люди изобрели механические и электронные машины. При выполнении почти любой задачи манипуляции, которые согласованы и в пространственном, и во временнóм отношении посредством взаимосвязанных процессов, оказываются намного более эффективными, чем использование отдельных инструментов.

3.2.29.  Белковые машины со взаимозаменяемыми деталями эффективно используют генетическую информацию

Дабы погрузиться в природу белковых машин глубже, мы рассмотрим относительно простую из них: убиквитинлигазу SCF. Этот белковый комплекс связывает

Рис. 3.78. Переносчик ABC (АТР-связывающая кассета) — белковая машина, которая перекачивает большие гидрофобные молекулы через мембрану. а) Бактериальный белок BtuCD, который импор-

тирует витамин B12 в E. coli, потребляя для этого энергию гидролиза ATP. Связывание двух молекул ATP приводит к образованию смычки между двумя ATP-связывающими субъединицами. Структура представлена в ADP-связанном состоянии, где канал во внеклеточное пространство, как можно видеть, открыт, но проход к цитозолю остается закрытым. б) Схематическое представление перекачки субстрата ABC-переносчиками. У бактерий связывание молекулы субстрата на внеклеточной стороне белкового комплексазапускаетгидролизATP,сопровождаемыйвысвобождениемADP,врезультатечегооткрывается проходкцитоплазме;послеэтогонасоспринимаетисходноесостояниевклеткахистановитсяготовым косуществлениюследующегоцикла.Вэукариотическихклеткахимеетместопротивоположныйпроцесс, входекоторогомолекулысубстратавыкачиваютсяизклетки.(ИзображениеапереработаноизK. P. Locher, Curr. Opin. Struct. Biol. 14:426–441,2004.СлюбезногоразрешенияиздательстваElsevier.)

Глава 3. Белки 281

связывается со специфическим участком на целевом белке, благодаря чему белок помещается в зазоре таким образом, что некоторые из его лизиновых боковых цепей входят в контакт с убиквитин-конъюгирующим ферментом. В результате этого фермент получает возможность многократно катализировать присоединение убиквитинового полипептида к этим лизинам (см. рис. 3.79, в), производя полиубиквитиновую цепь, которая становится меткой для быстрого разрушения целевого белка в протеасоме (см. разд. 6.2.21).

Подобным же образом определенные белки помечаются для быстрого разрушения в ответ на определенные сигналы, что способствует планомерному протеканию клеточного цикла (обсуждается в главе 17). Определение временнûх моментов разрушения зачастую предполагает создание специфической схемы фосфорилирования целевого белка, что необходимо для его опознания субъединицей F-бокс. Для такого рода хронометрирования также требуется активация убиквитинлигазы SCF, которая несет на себе сответствующий субстрат-связывающий отросток. Многие из таких отростков (субъединиц типа F-бокс) взаимозаменяемы в подобных белковых комплексах (см. рис. 3.79, б), и существует более 70 генов человека, которые их кодируют.

Как было подчеркнуто ранее, как только в результате эволюции появляется удачный белок, природа стремится дублировать его генетическую информацию, чтобы положить начало семейству родственных белков. Так, например, мало того что существует целое множество белков F-бокс, — что делает возможным узнавание различных наборов целевых белков, — имеется также и семейство каркасов (известных под более претенциозным названием куллинов), которые образуют семейство SCF-подобных убиквитинлигаз.

Давление естественного отбора на живые организмы, оказываемое с целью минимизировать число генов (см. разд. 5.1.2), возможно, помогает объяснить, почему РНК-сплайсинг столь распространен у высших эукариот, ибо это позволяет синтезировать многочисленные родственные белки из одного-единственного гена (обсудим это в главе 6). Белковая машина, построенная наподобие убиквитинлигазы SCF, с ее взаимозаменяемыми частями, аналогичным образом обеспечивает экономичное использование генетической информации в клетках, поскольку новые функции всего комплекса могут возникать в ходе эволюции попросту за счет появления альтернативного варианта одной из его субъединиц.

3.2.30.  Активация белковых машин зачастую предполагает размещение их на специфических участках

По мере того как ученые проникали во все более и более сокровенные тайны клеточной биологии, они постигали химию клетки на все более и более высоком уровне. Таким образом, кроме того что, как теперь знаем, преобладающую роль в ней играют белковые машины, недавно стало очевидно, что большинство таких машин формируется на определенных участках клетки и активируется только там и тогда, где и когда они необходимы. Используя флуоресцентно-меченые — слитые с зеленым флуоресцентным белком (GFP) — белки в живых клетках (см. разд. 9.1.9), цитологи могут проследить за изменением положения конкретных белков, которое происходит в ответ на определенные сигналы. Таким образом, когда некоторые внеклеточные сигнальные молекулы связываются с рецепторными белками в плазматической мембране, они часто привлекают группу других белков к внутренней поверхности плазматической мембраны, с тем чтобы сформировать

Глава 3. Белки 283

выполнения положенной функции в заданный момент времени. Как будет объяснено позже при обсуждении в главе 15 темы передачи сигналов в клетках, в подобного рода механизмы часто вовлечены процессы фосфорилирования белка, равно как и каркасные белки (scaffold proteins), которые сводят воедино набор активирующих, ингибирующих, адаптерных и субстратных белков в определенном местоположении в клетке.

Это общее явление известно как индуцированное сближение (induced proximity) и объясняет в некотором смысле то озадачивающее наблюдение, что немного различные формы ферментов с одним и тем же каталитическим участком зачастую имеют сильно отличающиеся биологические функции. Клетки меняют местоположение своих белков, ковалентно изменяя их множеством различных способов – как части «регуляторного кода», который будет описан позже.

В результате таких модификаций на белках создаются участки, которыми они связываются с определенными каркасными белками, что позволяет группировать белки, необходимые для протекания заданных реакций в определенных областях клетки. Большинство биологических реакций катализируют наборы из 5 и более белков, и такая кластеризация часто требуется для протекания реакции. Таким образом, благодаря каркасам клетки обретают возможность разделять реакции в пространстве – по зонам клетки – даже при отсутствии мембран. Хотя кластеризация такого рода лишь недавно признана широко распространенным явлением, особенно ярко оно представлено в ядре клетки (см. рис. 4.69).

Многие каркасы, как оказалось, весьма сильно отличаются от куллина, изображенного ранее на рис. 3.79: вместо того, чтобы удерживать связанные с ними белки в точно установленных положениях друг относительно друга, в случае механизма индуцированного сближения взаимодействующие белки сводятся воедино бесструктурными областями полипептидной цепи. В этом ограниченном пространстве белки часто сталкиваются друг с другом в случайных ориентациях — и некоторые столкновения в конечном счете приводят к продуктивной реакции (рис. 3.80, в). В сущности, этот механизм значительно ускоряет реакции за счет создания очень высокой локальной концентрации реагирующих веществ. По этой причине использование каркасных белков представляет собой особенно универсальный способ управления химией клетки (см. также рис. 15.61).

3.2.31.  Функционирование многих белков регулируется ковалентной модификацией

К настоящему моменту мы успели описать посттрансляционную модификацию белков только одного типа — ту, в ходе которой фосфат ковалентно присоединяется к боковой цепи аминокислоты (см. рис. 3.64). Однако на самом деле число других таких модификаций огромно – всего известно более 200 различных типов. Таблица 3.3 призвана создать ощущение этого разнообразия – в ней представлена подборка модифицирующих групп с известными регуляторными функциями. Как и в случае фосфата, эти группы присоединяются и затем удаляются с белков соответственно нуждам и потребностям клетки.

Теперь науке известно большое число белков, которые модифицируются не по одному, а по нескольким аминокислотным остаткам, причем различным регуляторным событиям соответствуют разные схемы таких модификаций. Поразительный пример являет нам белок p53, который играет центральную роль

284 Часть 1. Введение в мир клетки

Таблица3.3.Некоторыемолекулы,ковалентносвязанныесбелками,регулируютфункцииэтихбелков

Примечание: убиквитин представляет собой 76-аминокислотный полипептид; существует по крайней мере 10 родственных убиквитину белков, таких как SUMO, которые модифицируют белки аналогичным образом.

вуправлении реакцией клетки на неблагоприятные воздействия окружающей среды (см. разд. 17.6.4). Посредством одного из четырех различных типов молекулярных «присадок» этот белок может быть модифицирован на 20 различных участках (рис. 3.81, а). Ввиду того что возможно огромное число различных комбинаций этих 20 модификаций, поведение этого белка может, в принципе, быть изменено бесчисленным числом вариантов. Более того, схема модификаций на белке может определять его восприимчивость к дальнейшей модификации, как показано на примере гистона H3 на рис. 3.81, б.

Цитологи лишь недавно пришли к пониманию того, что присущий каждому белку набор ковалентных модификаций образует важный комбинаторный регуляторный код. Когда определенные модифицирующие группы присоединяются к белку или удаляются с него, этот код определяет тот или иной набор поведенческих характеристик белка, изменяя активность или стабильность самого белка, связывающихся

сним партнеров и его специфическое местоположение в клетке (рис. 3.81, в). Благодаря всему этому клетка имеет возможность быстро реагировать на изменения

всостоянии окружающей ее среды и быстро адаптироваться к новым условиям.

3.2.32.  В основе функционирования клетки лежит сложная сеть белковых взаимодействий

Даже в нашу «постгеномную» эру, когда известны полные последовательности геномов, перед молекулярными биологами все еще стоит немало сложнейших задач. Одна из них — необходимость разложить на элементарные звенья и воссоздать каждую из тысяч белковых машин, которые существуют в организме таких как мы с вами существ. Для понимания этих впечатляющих белковых комплексов каждый из них нужно воссоздать из очищенных составных частей, с тем чтобы затем изучать во всех подробностях принцип его работы в контролируемых усло-

286 Часть 1. Введение в мир клетки

виях – в пробирке, в отсутствие остальных компонентов клетки. Уже сама по себе такая задача неимоверно трудна. Но теперь мы знаем, что каждый из таких субкомпонентов клетки взаимодействует также и с другими наборами макромолекул, в результате чего образуется обширная сеть взаимодействий типа белок–белок и белок–нуклеиновая кислота, простирающаяся по всей клетке. Поэтому, для того чтобы постичь устроение клетки, мы должны проанализировать также и большинство других взаимодействий подобного рода.

Мы можем получить некоторое представление о сложности внутриклеточных белковых сетей, познакомившись с особенно хорошо изученным примером, описываемым в главе 16: многие десятки белков, которые взаимодействуют с актиновым цитоскелетом клетки у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (см. рис. 16.18). Степень или, лучше сказать, глубина таких межбелковых взаимодействий может быть оценена также и в более широком ракурсе. Огромное количество ценной информации теперь легко найти в базах данных белков по сети Интернет: десятки тысяч трехмерных структур белков плюс десятки миллионов последовательностей белков, полученных на основании нуклеотидных последовательностей генов. Ученые разрабатывают новые методы информационной «проходки» этого бескрайнего ресурса, чтобы повысить нашу осведомленность о клетках. В частности, компьютерные возможности биоинформатики в сочетании с робототехникой и технологиями, основанными на микроматрицах (см. разд. 8.5.19), позволяют исследовать тысячи белков в одной-единственной серии опытов. Для описания такого исследования, ориентированного на анализ белков в крупном масштабе, часто употребляют термин протеомика, который аналогичен термину геномика, описывающему широкомасштабный анализ последовательностей ДНК и генов.

Биологи используют два различных метода серийного картирования прямых взаимодействий между многими различными белками в клетке. Первоначальный выбор метода основывался на генетике: при помощи хитроумной техники, известной под названием дрожжевая двугибридная система скрининга (yeast two-hybrid screen) (см. рис. 8.24), были картированы десятки тысяч взаимодействий между тысячами белков у дрожжей, у нематоды и у плодовой мушки дрозофилы. Ближе к настоящему времени всеобщее признание обрел биохимический метод, основанный на аффинном мечении (affinity tagging) и масс-спектроскопии (обсуждается в главе 8), потому что он, как оказалось, дает меньше ложных результатов. Результаты этих и другого типа исследований, которые позволяют прогнозировать взаимодействия между белками, были сведены в таблицу и организованы в базы данных, доступные по сети Интернет. Это позволяет молекулярному биологу, изучающему небольшой набор белков, легко обнаружить, какие другие белки в той же самой клетке, как думают, связываются с белками из этого набора и, таким образом, взаимодействуют с ними. При графическом отображении в виде карты белковых взаимодействий (protein interaction map) каждый белок представлен прямоугольником, или квадратом, или точкой в двумерной сети, а прямые линии соединяют те белки, которые, как удалось установить, взаимодействуют друг с другом.

Когда на одной карте показаны сотни или тысячи белков, диаграмма сети становится ошеломляюще сложной и помогает понять, сколько еще нам предстоит постичь, прежде чем мы сможем утверждать, что действительно изучили клетку. Намного более полезны маленькие подразделы таких карт, высвечивающие лишь группу из нескольких интересующих нас белков. Так, на рис. 3.82 показана сеть межбелковых взаимодействий пяти белков, образующих SCF-убиквитинлигазу