Отчет по лабораторной работе по биофизике

«Качественный и количественный анализ гемолиза методом турбодиметрии»

Тесля П.Н., Бутков А.Д.

Цели работы. Приборы и принадлежности.

Целью данной работы является овладение методом турбодиметрического анализа лизиса клеток.

Приборы и принадлежности:

1. Фотоэлектрический колориметр КФК-2.

2. АЦП (ЛА-70).

3. Эритроцитарная суспензия.

4. Растворы хлорамина (1,5%; 2, 2%;5% и 3%.).

План проделанной работы.

1. Подготовительная работа с теоретическим материалом.

2. Изучение принципа работы с приборами.

3. Измерение светопропускания эритроцитарной суспензии.

4. Получение зависимости светорассеивания эритроцитарной суспензии от концентрации клеток.

5. Регистрация кинетик гемолиза.

6. Подсчет и обработка результатов, с помощью программы Excel.

7. Написание выводов и отчета по проделанной лабораторной работе и полученным результатам.

Теоретическое ведение

Способы измерения величины рассеивания оптического излучения

При исследовании процессов, протекающих в биологических объектах, часто возникают ситуации, при которых истинное поглощение света не изменяется, тогда как способность объекта рассеивать оптическое излучение изменяется весьма сильно. Примерами подобного рода ситуаций могут служить агрегация клеток, изменение их формы и размера, или их лизис. Поскольку в ходе указанных процессов изменения количества хромофоров в объекте, как правило, не происходит, то не меняется и способность объекта поглощать оптическое излучение. Однако все эти процессы сопровождаются изменением количества и формы оптических неоднородностей (т.е. рассеивающих центров) в объекте и, следовательно, изменением в способности рассеивать свет. Естественно, для исследования характеристик таких процессов удобно специально оценивать величину светорассеивания в них. Для измерения выраженности светорассеивания применяются 2 принципиально различающихся приёма, турбодиметрия и нефелометрия (рис. 1).

При турбодиметрии схема измерения световых потоков, выходящих из объекта, принципиально такая же, как и при обычной фотометрии (рис. 1): определяется величина потока излучения, выходящего из объекта без светорассеивания (т.е. не рассеянного или прямопроходящего потока излучения). Ясно, что при такой схеме измерения измеряемый световой поток будет тем меньше, чем сильнее светорассеивание в объекте. Для повышения чувствительности измерений в приборах, которые предназначены для турбодиметрических измерений, как правило, специально ограничивается телесный угол светосбора детектора. Достигается это за счет расположения кюветы далеко от детектора излучения и установки специальной диафрагмы, ограничивающей выходную (а иногда – и входную) апертуру кюветного отделения (рис. 1). Поскольку в областях спектра, где исследуемый объект способен еще и поглощать излучение, зависимость между поглощением света и его рассеиванием носит сложный характер, то для упрощения оценки результатов при измерениях светорассеивания чаще всего применяется излучение, кванты которого объектом заведомо не поглощаются. Для биологических объектов это красное видимое и ближнее инфракрасное излучение (650-900 нм). В таких условиях все регистрируемое ослабление проходящего прямо (не рассеянного) излучения будет определяться только собственно рассеиванием (см. работу № 3).

Нефелометрия основана на анализе потоков рассеянного излучения, выходящих из объекта. Для того, чтобы сделать это, фотодетектор в нефелометрах (приборах, предназначенных для нефелометрии) располагается таким образом, чтобы не рассеянное излучение на него не попадало, т.е. под некоторым углом  к направлению освещения объекта (рис. 1). Во многих нефелометрах предусмотрена возможность изменения угла . В результате можно получать зависимость интенсивности рассеянного излучения (J_pc) от . Зависимость J_pc=f() носит название индикатрисса рассеивания, и из ее анализа можно получить много полезной информации об ориентации, форме и некоторых других свойствах рассеивающих центров (в клеточных суспензиях ими являются собственно клетки). При =0^о нефелометрия трансформируется в турбодиметрию. Поскольку при нефелометрии измеряется поток рассеянного излучения, измеряемая величина нарастает по мере усиления рассеивания света в объекте.

J_пп

Рисунок 1. Турбодиметрическая (А) и нефелометрическая (Б) схемы измерения величины светорассеивания в биологических объектах. J_o – падающее излучение; J_pc – рассеянная компонента выходящего излучения; J_пп – не рассеянная (прямо проходящая) компонента выходящего излучения;  - угол между направлением освещения объекта и направлением регистрации выходящего излучения; ФД - фодетектор; К – кювета с образцом; Д – диафрагма, ограничивающая поперечное сечение измеряемого пучка излучения.

Поскольку турбодиметрические измерения технически проще, чем нефелометрические, а получаемой с их помощью информации часто оказывается достаточно для оценки исследуемого процесса, турбодиметрия распространена шире, чем нефелометрия. Именно этот подход используется и в данной работе.

При турбодиметрическом анализе светорассеивания тех типов, которые наблюдаются в клеточных суспензиях, в определенном интервале концентраций рассеивающих центров (т.е. клеток) выполняется закон Бугера-Ламбера-Бера:

,

где J_пп – интенсивность (или поток) не рассеянного (проходящего прямо) излучения;

J_o – интенсивность (или поток) падающего излучения

К – константа, величина которой зависит от условий измерения и свойств объекта (см. ниже);

С – концентрация рассеивающих центров (в клеточных суспензиях – обычно клеток или их агрегатов);

l – длина оптического пути.

В приведенной формуле вместо молярного коэффициента поглощения применяется константа К. Заметим, что К будет константой только для данного конкретного турбидиметра в данных конкретных условиях измерения, поскольку в принципе К изменяется при варьировании телесного угла светосбора, формы и размера рассеивающих центров, типа светорассеивания (при многократном рассеивании закон Бугера-Ламберта-Бера вообще не выполняется) и многих других показателей. Величину К для данного, конкретного, типа объекта, и данного, конкретного турбидиметра, определяют экспериментально. К другим объектам, анализируемым на этом же приборе, и даже к самому исследованному объекту при его измерениях его светорассеивания на других турбидиметрах, измеренная величина К уже неприменима.